高 林 馮愛芹 崔占軍 陳文靜 鄧錦波△

1）河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院 開封 475001 2）河南大學(xué)淮河醫(yī)院檢驗(yàn)科 開封 475001 3）河南大學(xué)神經(jīng)生物研究所 開封 475004

神經(jīng)酰胺作為重要的第二信使，日益受到人們的重視。大量的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究證明，神經(jīng)酰胺可以通過十余種下游分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1］。外界各種應(yīng)激因子（如紫外線、微波輻射）可以改變細(xì)胞膜上鞘磷脂／神經(jīng)酰胺的代謝產(chǎn)生生理病理過程，其機(jī)制涉及：（1）神經(jīng)酰胺信號通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。（2）通過改變脂筏結(jié)構(gòu)或穩(wěn)定性影響脂筏內(nèi)蛋白的聚集，最終影響信號通路的減弱或加強(qiáng)，引起細(xì)胞凋亡和增殖等生物學(xué)效應(yīng)。由此可見，鞘磷脂／神經(jīng)酰胺的代謝很是重要。在體內(nèi)，神經(jīng)酰胺的生成途徑主要有三種：（1）從頭合成途徑。（2）鞘磷脂循環(huán)途徑。（3）補(bǔ)救合成途徑。這三條合成途徑并不是彼此孤立的，而是相互聯(lián)系的，尤其是前兩條途徑。與前兩條途徑密切相關(guān)的代謝酶類主要有：絲氨酸-軟脂酰轉(zhuǎn)移酶（serine palmitoyl transferase，SPT）、鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS1and SMS2）和中性鞘磷脂酶（sphingomyelinase，N-SMase）。

酒精作為一個(gè)小的有機(jī)化合物，具有脂溶性和水溶性，沒有特殊的蛋白結(jié)合能力，以自由擴(kuò)散的方式很容易透過生物膜。在國外，酒精暴露研究更為關(guān)注對神經(jīng)系統(tǒng)的影響［2］?？偟膩碚f酒精的神經(jīng)毒性主要表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡，其機(jī)制涉及氧化應(yīng)激（oxidative pressure）、干擾神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)（conduction of neurotransmitter）、干擾Bcl-2家族活性（activation of Bcl-2family）、阻礙神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factors）作用等［3］。有研究證明，酒精暴露后可增加絲氨酸-軟脂酰轉(zhuǎn)移酶（SPT）活性，使得細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺水平增加。鑒于此，本課題認(rèn)為酒精暴露后中性鞘磷脂酶（N-SMase）和神經(jīng)酰胺的變化趨勢有著密切關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為C57BL／6J小鼠（由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），以孕期酒精暴露模型的建立參照以往的方法［4］，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：（1）高劑量組（high EtoH group）：每日25%酒精胃飼4.0g／kg。（2）低劑量組（moderate EtoH group）：每日25%酒精胃飼2.0g／kg。（3）對照組（control group）：每日蒸餾水胃飼4.0g／kg。在本實(shí)驗(yàn)中，選取E17、P0、P7和P14四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的仔鼠進(jìn)行觀察和數(shù)據(jù)收集，對照組與酒精模型組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取10只仔鼠作為研究對象。為了保證數(shù)據(jù)的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的準(zhǔn)確性，我們依據(jù)小鼠腦圖譜，把觀察的對象設(shè)定為視皮質(zhì)，具體部位為：在胚胎期，我們重點(diǎn)觀察皮質(zhì)板，出生后選定為V-VI層的神經(jīng)細(xì)胞。

1.2 儀器 激光掃描共聚焦顯微成像系統(tǒng)（Olympus，F(xiàn)V1000，日本），振蕩切片機(jī)（LR59590，美國），熒光顯微鏡（Olympus，BX61日本），N，N-亞甲雙丙烯酰胺、丙烯酰胺購于Fluka公司（美國）；預(yù)染蛋白Marker購于Fermentas公司（美國）。

1.3 方法

1.3.1 免疫細(xì)胞熒光染色定性定量分析神經(jīng)酰胺：本研究利用抗神經(jīng)酰胺熒光抗體標(biāo)記神經(jīng)細(xì)胞的Cer。震蕩切片，PBS洗三遍。0.2%Triton X-100通透10min，PBS洗三遍。與二抗相同宿主的血清封閉30min，PBS洗三遍。一抗4度濕盒內(nèi)孵育過夜（一抗：兔抗神經(jīng)酰胺單克隆抗體，1：100，Sigma-Aldrich（Saint Louis，MO）），PBS洗三遍。加熒光二抗（二抗：驢抗兔IgG Alexa Fluor 488.1：500），室溫孵育2h（避光）。甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照（Alexa Fluor 488激發(fā)波長約為494nm）。利用olympus-FV-1000圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)視野下完整的單個(gè)細(xì)胞熒光值。

1.3.2 N-SMase活性測定：用1×的緩沖液將樣品蛋白濃度稀釋至250μg／mL，按100μL／孔加至96孔反應(yīng)板，然后加入100μL反應(yīng)液，37℃進(jìn)行反應(yīng)45min，利用Spectramax M2酶標(biāo)儀，激發(fā)波長為544nm檢測OD562吸光度值。酶活性的吸光值＝各濃度組吸光值減去空白孔吸光值。

2 結(jié)果

2.1 孕期酒精暴露對子鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)酰胺含量的影響 Cer作為重要的第二信使，其變化趨勢將決定細(xì)胞的最終命運(yùn)。利用Cer免疫抗體檢測細(xì)胞內(nèi)Cer水平，有利于我們了解孕期酒精暴露對子鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Cer比對照組明顯增加，而且具有劑量依賴性。結(jié)果見表1。

2.2 孕期酒精暴露對子鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞N-SMase酶活性的影響 酒精的毒性機(jī)制十分復(fù)雜。酒精暴露導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、干擾神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)、干擾Bcl-2家族活性、阻礙神經(jīng)營養(yǎng)因子以及SM／Cer途徑等。N-SMase作為鞘磷脂向神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶，其酶活性的變化決定細(xì)胞內(nèi)Cer的水平。本研究結(jié)果表明，孕期酒精暴露導(dǎo)致子代小鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞SMase酶活性明顯增加。在E17時(shí)，二者均高于對照組；P0時(shí)，達(dá)到最高峰，P7和P14時(shí)，逐步下降。具有波動(dòng)性。結(jié)果見表2。

表1 孕期酒精暴露對各組子鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)酰胺表達(dá)影響 （±s，n＝10）

表1 孕期酒精暴露對各組子鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)酰胺表達(dá)影響 （±s，n＝10）

注：低劑量組與對照組相比，＊P＜0.05；高劑量組與對照組相比，＊＊P＜0.05

組別 熒光強(qiáng)度／細(xì)胞（×1000）E17 P0 P7 P14對照組0.87±0.10 0.90±0.11 0.91±0.14 1.89±0.09低劑量組（酒精2g／kg） 1.02±0.08＊ 1.14±0.09＊ 1.08±0.13＊ 1.15±0.12＊高劑量組（酒精4g／kg） 1.51±0.09＊＊ 1.68±0.12＊＊ 1.57±0.14＊＊ 1.61±0.08＊＊F 值15.67 24.15 21.68 19.34

表2 孕期酒精暴露對各組子鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞N-SMase酶活性的影響 （±s，n＝10）

表2 孕期酒精暴露對各組子鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞N-SMase酶活性的影響 （±s，n＝10）

注：低劑量組與對照組相比，＊P＜0.05；高劑量組與對照組相比，＊＊P＜0.05

組別 OD562光度值E17 P0 P7 P14對照組1078±102 1147±105 1026±95 1054±89低劑量組（酒精2g／kg） 1527±137＊ 1851±117＊ 1624±124＊ 1225±112＊高劑量組（酒精4g／kg） 1877±148＊＊ 2108±213＊＊ 1754±104＊＊ 1472±121＊＊F 值15.47 19.34 21.84 19.24

3 討論

Cer作為第二信使，調(diào)控細(xì)胞凋亡（包括自噬）、增殖、分化，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移，參與應(yīng)激、免疫、炎癥等多種生理、病理功能［5］。Cer作為SM的代謝產(chǎn)物，在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用［6］。在體、內(nèi)外酒精暴露實(shí)驗(yàn)中，用絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（serine palmitoyltransferase.SPT，Cer從頭合成途徑的限速酶）抑制劑（多球殼菌素myriocin）抑制Cer從頭合成途徑，神經(jīng)元胞內(nèi)Cer水平和凋亡率明顯下降［7］；用SMase抑制劑（desipramine）抑制SMase，細(xì)胞內(nèi)Cer水平和凋亡率也明顯降低［8］。由此可見，酒精暴露誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡伴隨著Cer的增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明孕期酒精暴露后子代小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的Cer水平明顯高于對照組。綜合以上資料，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為孕期酒精暴露后子代小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)聚集的Cer或直接通過CAPP（ceramide-activated Ser-Thr phosphatase）、PKC（protein kinase C）途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或間接經(jīng)Cer酶代謝為鞘胺醇通過PKH（Protein Kinase B homologue）、YPK（yeast protein kinase）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。

SMase主要有5種同工酶，能催化SM水解，生成Cer和膽堿［10］，其中N-SMase和A-SMase與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。N-SMase主要位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，主要參與SM和Cer相互轉(zhuǎn)換的SM循環(huán)；為此，我們測定了孕期酒精暴露后子代小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)N-SMase酶活性，結(jié)果顯示在孕期酒精暴露后子代小鼠的E17、P0、P7和P14，N-SMase的酶活性較各自的對照組都明顯增加。由此可見，孕期酒精暴露后子代小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)N-SMase酶活性的增加與Cer的增加具有同步性。這與其他文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

雖然影響Cer生成和聚集的因素多而復(fù)雜，但是對鞘磷脂、鞘磷脂酶和神經(jīng)酰胺的研究不僅僅是對酒精毒理機(jī)制的探索，也對提供預(yù)防缺血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和退行性神經(jīng)疾病具有重要意義。

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