盧振峰，秦春華，楊 艷，劉莉莉，俞 英，吳宏軍，劉愛榮，王雅春＊，史遠(yuǎn)剛

產(chǎn)奶性狀是受微效多基因控制的數(shù)量性狀，到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)其進(jìn)行了一系列研究，發(fā)現(xiàn)了眾多能對(duì)其產(chǎn)生影響的基因位點(diǎn)。其中，三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ATP－binding cassette super－family G member 2，ABCG2）基因突變被認(rèn)為是影響產(chǎn)奶性狀的一個(gè)比較重要的基因。

三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2（ATP－binding cassette super－family G member 2，ABCG2）基因，位于牛6號(hào)染色體上［1］。Olsen等［2］在BTA6上發(fā)現(xiàn)1個(gè)影響產(chǎn)乳性狀的QTL，ABCG2基因包含在此QTL中，之后在土耳其荷斯坦牛［3］、波蘭荷斯坦牛［4］等牛群中都檢測(cè)到ABCG2基因突變。2005年，Cohen－Zinder［5］和 Olsen［6］等分別在瑞士紅牛和以色列荷斯坦牛群體中研究發(fā)現(xiàn)ABCG2存在一個(gè)A－G的突變，該突變與低產(chǎn)乳量和高乳蛋白率、高乳脂率密切相關(guān)。此研究中的Y367C突變位于ABCG2基因的第9外顯子區(qū)，由堿基A－G的突變引起，并導(dǎo)致氨基酸由酪氫酸突變?yōu)榘腚装彼帷?/p>

本研究以內(nèi)蒙古三河牛為研究群體，分析ABCG2基因Y367C位點(diǎn)在三河牛群中的多態(tài)性，并分析其與產(chǎn)奶性狀之間的關(guān)系，以其為利用分子標(biāo)記輔助技術(shù)提高三河牛產(chǎn)奶性能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)群體

本研究的試驗(yàn)樣品為從內(nèi)蒙古呼倫貝爾市海拉爾區(qū)謝爾塔拉牛場(chǎng)核心群采集的181頭三河牛的EDTA抗凝血樣品。

產(chǎn)奶數(shù)據(jù)來自謝爾塔拉牛場(chǎng)，包括：305d產(chǎn)奶量（MY）、乳脂量（FY）、乳蛋白量（PY）、乳脂率（FP）、乳蛋白率（PP）、體細(xì)胞評(píng)分（SCS）。其中，體細(xì)胞評(píng)分與體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC）的轉(zhuǎn)換公式為：

1.2 ABCG2基因Y367C位點(diǎn)的檢測(cè)

位點(diǎn)檢測(cè)和群體分型選擇的是Sequenom Mass ARRAY Genotype分型技術(shù)，Y367C位點(diǎn)檢測(cè)的是A堿基和G堿基，以Y和C表示。

利用Sequenom Assay design軟件設(shè)計(jì)引物序列，針對(duì)Y367C位點(diǎn)A／G突變的引物有三條：PCR擴(kuò)增引物 R＇－ACGTTGGATGGCCTGGAAATCCATTT－GAGC 和 R＇－GGCATAAGTGACCTCCTTGC，單堿基延伸引物R＇－GGCATAAGTGACCTCCTTG。分型試驗(yàn)由博淼生物科技（北京）有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)檢測(cè)的基因型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算基因型頻率、基因頻率，并進(jìn)行 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)。用SAS 9.1軟件的一般線性模型（GLM）對(duì)基因型效應(yīng)進(jìn)行分析。采用固定效應(yīng)模型：Y＝μ＋Year＋Season＋Parity＋SNP＋e，其中Y為性狀表型值，μ為群體平均值，Year為產(chǎn)犢年效應(yīng)，Season為產(chǎn)犢季節(jié)效應(yīng)，Parity為胎次效應(yīng)，SNP為基因型效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP分型結(jié)果

Sequenom Mass ARRAY Genotype分型技術(shù)直接給出每個(gè)個(gè)體在兩個(gè)SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，基因頻率、基因型頻率見表1，遺傳多樣性指標(biāo)見表2。從表中可以看出，ABCG2位點(diǎn)的YY基因型頻率為0.96，為優(yōu)勢(shì)基因型。此位點(diǎn)的MAF（最小等位基因頻率）值為0.02，PIC（多態(tài)信息含量）值小于0.25，為低度多態(tài)。Hardy－Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，Y367C在此三河牛群體中處于平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

表1 Y367C位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率

表2 Y367C位點(diǎn)多態(tài)性分析以及Hardy－weinberg檢驗(yàn)

2.2 與產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)分析

利用最小二乘法對(duì)三河牛體細(xì)胞評(píng)分（SCS）、305d產(chǎn)奶量（MY）、乳脂率（FP）、乳蛋白率（PP）、乳脂量（FY）、乳蛋白量（PY）進(jìn)行方差分析和基因替代效應(yīng)分析。結(jié)果見表3和表4。

方差分析結(jié)果（表3）顯示：ABCG2基因Y367C位點(diǎn)的YY基因型具有最低的體細(xì)胞評(píng)分和最高的乳蛋白率；YC基因型個(gè)體具有最高的乳脂率；CC個(gè)體有最高的產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量。但三種基因型差異均不顯著（P＞0.05）。

基因效應(yīng)分析結(jié)果（表4）顯示：Y等位基因降低體細(xì)胞評(píng)分，提高了乳蛋白率；而C等位基因則有助于提高產(chǎn)奶量、乳脂率，乳脂量和乳蛋白量。

表3 Y367C位點(diǎn)不同基因型產(chǎn)奶性狀的最小二乘均值

表4 Y367C位點(diǎn)基因效應(yīng)分析結(jié)果

3 討論

本研究首次在三河牛群體中檢測(cè)ABCG2基因的Y367C突變，并發(fā)現(xiàn)Y367C位點(diǎn)的YY基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，Y367C位點(diǎn)為低度多態(tài)，Hardy－Weinberg平衡檢測(cè)結(jié)果顯示，此SNP在三河牛群體中均處于平衡狀態(tài)（P＜0.05），表明在該群體中的人工選育對(duì)這此基因座的選擇壓不強(qiáng)。

路國(guó)彬等［8］在中國(guó)荷斯坦奶牛中ABCG2基因的第九外顯子進(jìn)行了研究，檢測(cè)到Y(jié)367C突變位點(diǎn)，分析發(fā)現(xiàn)YY型為優(yōu)勢(shì)基因型，CC基因型個(gè)體產(chǎn)奶性能優(yōu)于其余基因型個(gè)體，但差異不顯著。而本試驗(yàn)是第一次在三河群體牛中檢測(cè)Y367C位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)純合子YY基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，CC基因型個(gè)體在產(chǎn)奶性能方面也優(yōu)于其余基因型個(gè)體，但同樣未發(fā)現(xiàn)顯著差異。

本研究通過對(duì)ABCG2基因的Y367C位點(diǎn)進(jìn)行了與產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)三種基因型表型值差異不顯著，這與路國(guó)彬等的研究結(jié)果一致。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)ABCG2基因進(jìn)行了大量研究，但大部分都是針對(duì)的 Y581S 突變［9－13］，對(duì)Y367C的報(bào)道非常罕見。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然在三河牛群體中CC基因型個(gè)體在產(chǎn)奶量、乳脂量和乳蛋白量方面優(yōu)于YY基因型個(gè)體和CC基因型個(gè)體，但差異并不顯著。這主要是由于本試驗(yàn)群體數(shù)量有限，導(dǎo)致有些基因型個(gè)體的數(shù)量太少，如CC基因型個(gè)體僅檢測(cè)到一個(gè)，誤差會(huì)不可避免地增大，下一步試驗(yàn)應(yīng)擴(kuò)大群體的規(guī)模進(jìn)一步驗(yàn)證此位點(diǎn)的功能。

［1］Ron M，Kliger D，F(xiàn)eldmesser E，etal.Multiple quantitative trait locus analysis of bovine chromosome 6in the Israeli Holstein population by a daughter design［J］.Genetics，2001，159：727－735.

［2］Olsen H G，Gomez－raya L，Vagde I，etal.A genome scan for quantitative trait loci affecting milk production in Norwegian dairy cattle［J］.J Dairy Science 2002，85（11）：3124－3130.

［3］Muratyildirim，Elifsahin.ABCG2Gene Polymorphism in Holstein Cows of Turkey［J］.Kafkas Univ Vet Fak Derg，2010，16（3）：473－476.

［4］J komisarek，Z Dorynek.Effect ofABCG2，PPARGC1A，OLR1 and SCD1gene polymorphism on estimated breeding values for functional and production traits in Polish Holstein－Friesian bulls［J］.Journal of Applied Genetics，2009，50（2）：125－132.

［5］Cohen－Zinder，Denis M，Larkin，etal.Identification of a missense mutation in the bovineABCG2gene with a major effect on the QTL on chromosome 6affecting milk yield and composition in Holstein cattle［J］.Genome Research，2005，15（7）：936－944.

［6］Olsen H G，Nilsen H，Hayes B，etal.Genetic support for a quantitative trait nucleotide in theABCG2gene affecting milk composition of dairy cattle［J］.Genetics，2007，8：32.

［7］王興平，許尚忠，等.牛TLR4基因的遺傳多態(tài)性與乳房炎的關(guān)聯(lián)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2007，38（2）：120－124.

［8］路國(guó)彬，李宏濱，等.中國(guó)荷斯坦奶牛ABCG2基因外顯子9多態(tài)性研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（1）：22－26.

［9］Madhu S Tantia，Ramesh K，Vijh，Bishnu，etal.DGAT1andABCG2polymorphism in Indian cattle（Bosindicus）and buffalo （Bubalusbubalis）breeds［J］.BMC Veterinary Research，2006，2：32.

［10］Song J L，Zhang M，Chang J Z，etal.ABCG2polymorphisms of the Chinese bufflo（Bubalusbubalis）and yak （Bosgrunniens）breeds.［J］.Buffalo Bulletin，2011，30（1）

［11］Otero J A，Real R，De La Fuentea，etal.The Bovine ATPBinding Cassette TransporterABCG2Tyr581Ser Single－Nucleotide Polymorphism Increases Milk Secretion of the Fluoroquinolone Danofloxacin［J］.Drug Metabolism and Disposition，2013，41（3）：546－549.

［12］R RealEAL，L GonzáLez－lobato，M F Baro，etal.Analysis of the effect of the bovineABCG2SNP Y581Son transcellular transport ofveterinary drugs using new cell culture models［J］.Journal of AnimalScience，2011，89（12）：4325－4338.

［13］Ron M，Cohen－Zinder M，Peter C，etal.Short communication：apolymorphism inABCG2in Bosindicus and Bostaurus cattle breeds［J］.Journal of Dairy Science，2006，89（12）：4921－4923.