劉小轉(zhuǎn)，潘新娟，張 麗

腭裂是口腔頜面部最常見的先天性畸形之一。引起先天性腭裂發(fā)生的原因包括遺傳因素和環(huán)境因素,約20%腭裂歸因于遺傳因素, 80%以上原因未知[1]。維甲酸是維生素A的生物活性形式，在生物體的胚胎發(fā)育、器官形成，細(xì)胞增殖及分化和維持正常生理功能中起重要作用。然而，維甲酸也是一種常見致畸物，過量的維甲酸能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生[2]。在眾多組織中維甲酸可以調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子 (transforming growth factor-β, TGF-β)亞型的表達(dá)，其中就包括胚胎的組織和細(xì)胞[3]。在細(xì)胞增殖和分化過程中，維甲酸對TGF-β信號途徑的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要[4]。TGF-β超家族是一類具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子, 是一種細(xì)胞生長的雙向調(diào)節(jié)因子。有研究顯示TGF-β亞型在腭發(fā)育過程中具有時空表達(dá)的特性[5]。在本次實驗中，建立由維甲酸誘導(dǎo)的昆明小鼠腭裂動物模型，并在此基礎(chǔ)上用免疫組化的方法檢測P-Smad在腭突發(fā)育過程中的表達(dá)情況，以探討維甲酸誘導(dǎo)腭裂發(fā)生的過程中對TGF-β/Smad信號途徑的影響，并分析其可能的致畸機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及標(biāo)本制備選用昆明小鼠(由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供)，8周齡左右，雌鼠體質(zhì)量30 g以上，雄鼠體質(zhì)量35 g以上。雌雄比例為3∶1，前1天晚8時同籠，第2天上午8時檢栓。將陰栓陽性的雌鼠記為妊娠0 d(gestation 0 day,GD0)。共得到孕鼠24只，隔離飼養(yǎng)，于GD10 d下午1時，24只孕鼠隨機(jī)分兩組：第1組為對照組，共12只；第2組為實驗組，共12只。實驗組管飼全反式維甲酸(購于Sigma公司) ，劑量為100 mg/kg，溶于0.2 mL玉米油中；對照組管飼等體積的玉米油。分別于妊娠12、13、14.5、15、15.5、16 d 6個時間點頸椎脫臼處死孕鼠，每組各2只，剖腹取胎鼠，截取胎鼠頭部。4%多聚甲醛固定6 h，梯度酒精脫水，頭喙部朝下， 常規(guī)石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片，60℃烤箱置8 h，用于HE染色和免疫組化研究。

1.2實驗藥品及試劑全反式維甲酸(美國Sigma公司)，P-Smad多克隆抗體(美國Chemicon/Upstate公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)。

1.3HE染色實驗組與對照組包埋的組織標(biāo)本做HE染色，光鏡下觀察腭突發(fā)育的動態(tài)過程。

1.4免疫組化染色采用ABC法，切片脫蠟至水，0.3%H2O2室溫下孵育10 min，正常羊血清孵育20 min，滴加兔抗鼠P-smad 2抗體(1∶800)， 4℃濕盒過夜，37℃復(fù)溫1 h，滴加生物素化二抗，37℃孵育30 min，滴加酶結(jié)合物，37℃孵育30 min，DAB顯微鏡下控制顯色5～10 min。上述各步之后均用0.01 mol/L PBS振洗3次，每次5 min。用0.01 mol/LPBS緩沖液代替一抗染色的切片作陰性對照，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，封片。

2 結(jié)果

2.1小鼠上腭大體標(biāo)本的形態(tài)觀察腭裂畸形在肉眼下較難觀察，需借助放大鏡或解剖顯微鏡。鏡下可見對照組E16 d小鼠上腭融合完全， 有明顯的腭

皺。實驗組E16 d小鼠腭裂均為正中裂，全層裂開，兩側(cè)腭突及鼻中隔均未相連(見圖1)。

A：對照組，B：實驗組

2.2光學(xué)顯微鏡觀察小鼠腭部發(fā)育的動態(tài)變化對照組：E12 d 舌體位置很高，側(cè)腭突剛剛從原始口腔內(nèi)的上頜突中長出。E13 d舌體位置接近鼻中隔，腭突在舌側(cè)垂直生長。E14.5 d舌體下降，腭突上抬，達(dá)到舌體之上，處于水平狀態(tài)，雙側(cè)腭突逐漸接觸，形成中縫。E15 d～E15.5 d兩側(cè)腭突接觸后并融合，中縫逐漸消失。至E16 d所有標(biāo)本兩側(cè)腭突完全融合，腭間質(zhì)貫通(見圖2)。實驗組：E12 d～E13 d在腭突的剛長出到垂直生長期，舌體及腭突的位置、形態(tài)與對照組無明顯差異。E14.5 d當(dāng)腭突上抬時，出現(xiàn)腭突的上抬延遲。E15 d～E16 d兩側(cè)腭突未接觸，形態(tài)較對照組小，形成腭裂(見圖3)。

A：E12 d，B: E13 d，C：E14.5 d，D：E15 d，E：E15.5 d，F(xiàn)：E16 d

A：E12 d，B: E13 d，C：E14.5 d，D：E15 d，E：E15.5 d，F(xiàn)：E16 d

2.3維甲酸對TGF-β/Smad信號途徑的抑制作用對照組：在E12 d～E13 d腭突的剛長出到垂直生長期，腭突上皮內(nèi)無P-Smad2陽性表達(dá)。在E14 d～E14.5 d腭突上抬至水平位置階段，腭突上皮中出現(xiàn)P-Smad2陽性表達(dá)，提示在正常腭發(fā)育過程中TGF-β/Smad信號被激活。在垂直生長期和融合后期，腭突上皮內(nèi)無P-Smad2陽性表達(dá)。實驗組：自始至終腭突的上皮中均檢測不到P-Smad2陽性表達(dá)(見圖4)。

DAB顯色，蘇木素復(fù)染，棕褐色為陽性

3 討論

脊椎動物的腭的發(fā)育過程是非常相似的。左右腭突移向舌面上方，并逐漸接觸，接觸處的中嵴上皮組織變厚形成橋粒，把二者連在一起，并形成中嵴上皮縫，這些中縫上皮在組織的連接匯合處進(jìn)行上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終完全融合[6]。腭突中嵴上皮細(xì)胞是一種在融合前位于腭突近中線邊緣的外胚層細(xì)胞，與腭裂發(fā)生有著密切的關(guān)系。最初的MEE細(xì)胞分為兩層，當(dāng)腭突上抬并向水平方向生長后，表層MEE細(xì)胞開始脫落，至兩側(cè)腭突接觸前完全脫去，MEE細(xì)胞變?yōu)閱螌蛹?xì)胞[7]。在兩側(cè)的上皮發(fā)生接觸前，細(xì)胞的DNA已經(jīng)停止合成24～36 h，當(dāng)上皮層的基地細(xì)胞暴露時，上皮層內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生生理性死亡，表面的細(xì)胞開始脫落，細(xì)胞黏著形成僅含有兩層基底細(xì)胞的上皮縫，最后發(fā)生融合，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為MEE細(xì)胞的最終轉(zhuǎn)歸形式包括兩種：一是退化或死亡；二是上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

腭突的融合與中嵴上皮細(xì)胞復(fù)雜變化緊密相關(guān)，由很多生長因子調(diào)控，其中包括TGF-β。哺乳動物TGF-β共有3種: TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，這3種亞型均參與腭發(fā)育的眾多生物過程，例如細(xì)胞的遷移、上皮間質(zhì)間的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與沉積、基底膜的退化、細(xì)胞的增殖和凋亡[8]等。在腭突融合的過程中，TGF-β及其下游信號分子Smad2/ Smad3具有時空表達(dá)的特性。TGF-β家族成員通過激活一系列的絲氨酸酶和蘇氨酸酶起作用。一個激活的TGF-β配體由細(xì)胞膜錨定的TβRIII遞呈給跨膜信號的受體TβRI和TβRII、TβRI和TβRII隨后又激活細(xì)胞內(nèi)的Smad蛋白，受體調(diào)控的Smad蛋白具有高度的同源性，通過磷酸化激活的Smad2和Smad3與通路中的共調(diào)控蛋白Smad4形成一聯(lián)合體，一起轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控TGF-β效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[9]。

10年前，TGF-β3-/-突變型小鼠腭裂的發(fā)生，使人們發(fā)現(xiàn)TGF-β3在腭裂發(fā)育過程中起著重要的作用[10]。在這些突變體中，腭裂的發(fā)生是由兩側(cè)腭突的上皮無法融合所導(dǎo)致。不久人們又發(fā)現(xiàn)外源性TGF-β3可以促使TGF-β3-/-突變型小雞上腭的融合，這個過程主要是通過MEE細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化完成的[11]。在腭突融合過程中，Smad2的磷酸化在空間上局限于腭突的中嵴上皮細(xì)胞，在時間上也與中嵴上皮的退化、消失密切相關(guān)。在TGF-β3-/-突變型胎鼠腭突中嵴上皮中間測不到磷酸化Smad2的表達(dá)，然而，如果加入外源性磷酸化Smad2，則可以挽救TGF-β3-/-突變型胎鼠腭裂的發(fā)生[12]。另外，Smad2基因敲除小鼠不能形成中胚層，胚胎在原腸胚形成過程中或者形成后就已經(jīng)死亡[13]，因此很難明確地研究Smad2在腭發(fā)育過程中的具體作用。然而，Smad3基因敲除小鼠，出生時無明顯的缺陷，而且存活良好。由此可見，Smad3在腭發(fā)育過程中并不起作用，在功能上可以由Smad2補(bǔ)償[14]。維甲酸是一種常見致畸物，過量的維甲酸能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示：在腭突融合過程中，維甲酸可以抑制Smad2的磷酸化從而抑制TGFβ/Smad信號途徑。由此可以推斷，維甲酸誘導(dǎo)腭裂的發(fā)生，與中嵴上皮細(xì)胞中TGFβ/Smad信號途徑的抑制密切相關(guān)。

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