龍鐘明，王 利，茍小蘭，劉港彪，冀國幀，韋 璇

（西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，四川 成都 610041）

目前，國內(nèi)外對江團研究報道得較少，主要集中在江團池塘養(yǎng)殖和養(yǎng)殖營養(yǎng)需求等方面，對江團的細菌性疾病鮮見報道。吉氏檸檬酸桿菌為檸檬酸桿菌屬細菌，革蘭氏陰性，需氧或兼性厭氧。近年來，國外研究者已在人及水生動物中報道了吉氏檸檬酸桿菌。國內(nèi)尚缺乏對該菌的研究。本文筆者通過生理生化實驗、16S rDNA序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對江團吉氏檸檬酸桿菌進行了分離鑒定，并進行了藥敏試驗，旨在為江團細菌性病原的鑒定和防治以及江團資源的保護和利用積累科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料 發(fā)病江團來自四川某養(yǎng)殖場。江團體長7 cm，21g，體表黏液較多，胸鰭、腹鰭基部充血，肛門輕微紅腫。主要試劑：SS瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、生化鑒定藥品和藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。TaqMix、DNA MarkerDL2000 等 購 自 TIANGEN BIOTECH（BEIJING）公司。

1.2 細菌的分離和菌落形態(tài)觀察 無菌操作取江團心臟等組織，劃線接種到營養(yǎng)瓊脂和SS瓊脂培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)12h。待平板長出單一菌落后，挑選單個菌落劃線純化，純化菌株于4℃保存。將純化菌株分別劃線接種到MC、SS、營養(yǎng)瓊脂中觀察菌落形態(tài)。

1.3 生理生化鑒定 將純化菌穿刺接種到細菌生化特性鑒定管中，進行H2S、動力性、尿酶、檸檬酸鹽利用、糖類等理化特性測定。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》對菌株進行鑒定。

1.4 16S rDNA基因序列分析

1.4.1 基因的擴增和測序 模板制備：取一EP管加入100μL滅菌ddH2O，挑取槍頭大小的經(jīng)過24h培養(yǎng)的細菌菌落于滅菌ddH2O中，制成懸液，置-80℃凍存1h后，迅速置入沸水浴中20min，然后12000r/min離心5min，取上清作為細菌粗提模板，-20℃保存?zhèn)溆?。采用細?6S rDNA通用引物（正向引物：AGAGTTTGATCCTGGC TTAG，反向引物：ACGGCTACCTTGTTACGACTT）進行PCR擴增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：上游引物1.0μL，下游引物1.0μL（引物濃度均為 10μmol/L），ddH2O 25μL，2×Taq PCR MasterMix 20 μL，模板 3.0 μL，總體系為 50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 4 min，5 個循環(huán)；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，5 個循環(huán)；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 4min，30個循環(huán)。PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性樣品送交北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用Blastn程序?qū)闖T-0603 16S rDNA序列進行同源性檢索，找出相似性最高的菌種及同屬菌種作為內(nèi)群，另外選取檸檬酸屬的布氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌和氣單胞菌屬的維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等幾種細菌作為外群。用ClustalX2軟件進行多序列全局比對，利用MEGA5.0軟件，Neighbour-Joining方法，采用Kimura 2-parameter校正模型，自舉1000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 藥敏試驗 藥敏試驗采用K-B法，挑取待檢細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，調(diào)到0.5個麥氏標準，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液均勻涂布于MH瓊脂平板，再貼上藥敏紙片，28℃培養(yǎng)18 h后，觀察并測量抑菌圈大小。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài) 在營養(yǎng)瓊脂上的菌落直徑一般為2～4 mm，光滑、低凸、濕潤、半透明或不透明，灰色，表面有光澤，邊緣整齊。革蘭氏陰性，單個或成對，直桿菌。

2.2 生化鑒定 該細菌主要的理化特性為具有動力性，不發(fā)酵側(cè)金盞花醇、山梨醇、木糖等；葡磷胨水、蛋白胨水、賴氨酸、尿素、鳥氨酸、苯丙氨酸等呈陰性反應(yīng)；硫化氫、檸檬酸鹽、葡萄糖產(chǎn)氣、葡萄糖酸鹽呈陽性反應(yīng)，其生化特性見表1。參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》，初步判斷該菌為吉氏檸檬酸桿菌。

表1 菌株JT-0603生化試驗結(jié)果

2.3 16S rDNA序列分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果見圖1。經(jīng)測序分析，16S rDNA序列片段大小為1 446 bp，將此序列提交至 GenBank，收錄號為JN571748。測序結(jié)果比對分析顯示，該細菌的16S rDNA與GenBank中吉氏檸檬酸桿菌不同分離株的相似性最高達97%。選取相似度較高的菌株及相關(guān)菌株運用ClustalX2、MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖2。分離菌株（圖中以“◆”標記）與吉氏檸檬酸桿菌DQ23881.1、吉氏檸檬酸桿菌NR041697.1等聚為一簇，且Bootstrap檢驗值達67，可以初步確定該菌株為吉氏檸檬酸桿菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗表明，菌株JT-0603對環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑、痢特靈、氟哌酸、鏈霉素、氟苯尼考、恩諾沙星等藥物高度敏感；對強力霉素、氨芐青霉素低度敏感；對紅霉素耐藥。結(jié)果詳見表2。

圖1 16S rDNA PCR擴增結(jié)果

圖2 菌株JT-0603 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育進化樹

表2 菌株JT-0603藥敏試驗結(jié)果

3 分析及結(jié)論

3.1 Brenner等對112株檸檬酸桿菌進行了DNA雜交試驗，并進行了分類，其中除吉氏檸檬酸桿菌外，還包含有弗氏檸檬酸桿菌、科氏檸檬酸桿菌、法氏檸檬酸桿菌等11個基因種。對于多數(shù)檸檬酸桿菌株而言，檸檬酸鹽可作為唯一碳來源。弗氏檸檬酸桿菌是以檸檬酸鹽為唯一碳源，但是一些吉氏檸檬酸桿菌卻不能利用檸檬酸鹽，JT-0603菌株表現(xiàn)為陽性。賴氨酸不能被脫羧基。鳥氨酸能被布氏檸檬酸、法式檸檬酸等利用，但是不能被吉氏檸檬酸等脫羧基化。檸檬酸屬只有柯氏檸檬酸才發(fā)酵側(cè)金盞花醇。弗氏、布氏和楊氏檸檬酸桿菌等能在加有硫化氫的克氏雙糖鐵瓊脂和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上生長，而菌株JT-0603也表現(xiàn)為陽性。右旋葡萄糖能被大部分的檸檬酸桿菌用來產(chǎn)酸產(chǎn)氣。本試驗菌株JT-0603的生理生化特性基本符合吉氏檸檬酸桿菌的特性。

3.2 16SrRNA為核糖體RNA的一個亞基，而16SrDNA是編碼該亞基的基因。16S rDNA普遍存在于各種細菌中。16S rDNA由保守區(qū)和可變區(qū)交錯排列組成。保守區(qū)為所有細菌所共用，而可變區(qū)可以用來區(qū)分不同的細菌。由于16S rDNA具有保守區(qū)和特異區(qū)并存的特點，使其在病原菌的臨床檢測中具有篩選和鑒別的雙重作用。用此方法已鑒定出弗氏檸檬酸桿菌、賽氏檸檬酸桿菌。本試驗通過16S rDNA基因序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，證明了菌株JT-0603為吉氏檸檬酸桿菌，從而也印證了16S rDNA基因分析是進行細菌鑒定的有效方法。

3.3 本研究藥敏試驗結(jié)果顯示，菌株JT-0603僅對紅霉素耐藥。紅霉素是國家禁用藥物，應(yīng)嚴格禁止濫用，也可能是該菌具有紅霉素的抗性基因。本菌株對氨芐青霉素、強力霉素等臨床上常用的抗生素低度敏感，這可能與養(yǎng)殖戶過度使用這些抗生素有關(guān)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，要慎重使用抗生素，防止細菌耐藥性的產(chǎn)生與加重，避免濫用藥物對養(yǎng)殖環(huán)境造成污染。而一旦發(fā)生疾病，應(yīng)及時診斷，使用國家允許的漁用藥物治療。如果鑒定出吉氏檸檬酸桿菌為病原菌，可以根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，采用敏感性藥物進行治療，從而減少疾病造成的損失。

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