高蒙蒙，孫桂波，斯建勇，秦 蒙，羅 云，孟祥寶，王 敏，孫曉波

血管內皮細胞與血管生理學的許多方面(如血管舒張、血管再生、炎癥和屏障功能等)密切相關，內皮細胞損傷是導致動脈粥樣硬化和高血壓的關鍵因素［1］。氧化應激被認為是導致內皮細胞損傷的主要病理因素［2－3］，因而尋找具有抗氧化應激作用的化合物對于治療心血管疾病具有重要的臨床意義。

紅車軸草中富含黃酮類、蛋白質、氨基酸、糖類和維生素等多種成分，其中16種黃酮類物質已被檢測出，總含量占干重的2%［4］。具有潛在抗氧化作用的黃酮類化合物是治療和預防心血管疾病的中草藥的主要有效成分。研究發(fā)現紅車軸草總黃酮(Red clover flavonoids，RCF)具有抗氧化作用［5］，且其中的芒柄花素、染料木素等可舒張動脈血管，從而減少動脈粥樣硬化的發(fā)生［6］;血壓正常的絕經期女人食入紅車軸草總黃酮(如芒柄花黃素等)可防治動脈血管硬化并減少總血管阻力［7］，以上研究顯示紅車軸草總黃酮在預防和治療心血管疾病中具有潛在應用價值。紅車軸草來源廣泛、價格低廉，具有明顯的新藥研發(fā)優(yōu)勢。但目前關于紅車軸草總黃酮對血管內皮細胞損傷的保護作用及作用機制未見報道。本研究采用體外培養(yǎng)內皮細胞ECV-304的方法，建立H2O2對內皮細胞ECV-304的氧化損傷模型，進一步探究紅車軸草總黃酮對內皮細胞損傷的保護作用及其作用機制，為開發(fā)紅車軸草總黃酮治療心腦血管疾病提供實驗資料和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 紅車軸草總黃酮由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所化學室提供，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后保存?zhèn)溆?，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購自 Gibco公司。LDH、SOD、MDA、CAT、GSH-Px試劑盒均購于南京建成生物工程研究所;H2O2購于北京化工廠;胰酶、四氮唑蘭(MTT)購自SIGMA公司。

1.2 主要儀器 倒置顯微鏡(日本Olympus);超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司);酶標儀(美國BioTek);離心機(中國 Anke);細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo);熒光倒置顯微鏡(德國萊卡)。

1.3 方法

1.3.1 人臍靜脈血管內皮細胞ECV-304的培養(yǎng)人臍靜脈血管內皮細胞株(內皮細胞ECV-304)由中國科學院上海細胞生物學研究所提供。鏡下細胞呈“鋪路石”樣，多行性或短梭形鑲嵌排列。當細胞生長融合至80%時，將瓶內舊培養(yǎng)液倒掉，PBS液輕洗細胞2～3次。加入1 ml左右0.125%胰酶，至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 min，鏡下見細胞皺縮變圓、細胞間隙增大時，吸棄胰酶，加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液以終止胰酶的作用，用吸管反復輕輕吹打細胞，使之從瓶壁脫落成細胞懸液。細胞計數，調細胞密度為1×105個/ml，接種于96孔板每孔 100 μl，置于 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。約 24 h后待細胞達融合狀態(tài)時用于實驗。

1.3.2 H2O2誘導人臍靜脈血管內皮細胞損傷模型的建立 內皮細胞ECV-304血管內皮細胞以104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板。用無血清培養(yǎng)基將H2O2配成 0、75、150、300、600、800 μmol·L－1劑量組，分別加入96孔板中，每孔100 μl，分別作用12、24、48 h 后，將上清棄掉，每孔加入100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTT(5 g·L－1)作用 4 h，將上清棄掉，每孔加150 μl DMSO，微孔振蕩器上振蕩 10 min，570 nm 酶標儀下測細胞吸光度值(A)。細胞抑制率/%=(空白組吸光度值－各組吸光度值)(A)/空白組吸光度值(A)×100%

1.3.3 紅車軸草總黃酮對H2O2損傷血管內皮細胞保護作用的時效關系研究 紅車軸草總黃酮用DMSO溶解，用量為每1 mg藥物加10 μl DMSO。內皮細胞ECV-304以104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，主要分以下兩組實驗:①紅車軸草總黃酮對正常內皮細胞的影響:紅車軸草總黃酮用無血清DMEM溶解，并將其配制成 12.5、25、50 mg·L－13 個劑量，正常對照組每孔100 μl無血清培養(yǎng)基，藥物組每孔100 μl含藥溶液，預孵育4 h后，MTT法檢測細胞存活率。②紅車軸草總黃酮對H2O2誘導的內皮細胞損傷的保護作用:正常對照組每孔加100 μl無血清培養(yǎng)基，紅車軸草總黃酮 12.5、25、50 mg·L－1各劑量組分別預孵育2、4 h后，棄上清，加100 μl 300 μmol·L－1H2O2作用 24 h后，MTT法檢測細胞存活率。細胞存活率/%=各組吸光度值(A)/空白組吸光度值(A)×100%。以確定紅車軸草總黃酮保護H2O2誘導的血管內皮細胞損傷的最佳作用時間和作用濃度。

1.3.4 紅車軸草總黃酮對H2O2誘導的血管內皮細胞損傷的保護作用 將細胞以2×105個/孔接種于6孔板，實驗分為5組，正常對照組(control):每孔給予2 ml無血清培養(yǎng)基;模型組(model):每孔給予 2 ml終濃度為 300 μmol·L－1H2O2，作用 24 h;紅車軸草總黃酮給藥組(RCF):給予2 ml終濃度為12.5、25、50 mg·L－1的紅車軸草總黃酮，孵育 4 h后，給予 2ml終濃度為 300 μmol·L－1H2O2作用 24 h。① 進行H33342和PI染色:加入2 ml終濃度為1 g·L－1的 Hoechst33342 和 PI，37 度孵箱孵育 15 min，PBS洗3次，熒光倒置顯微鏡下觀察內皮細胞形態(tài)學;②檢測細胞上清液中LDH的漏出量，細胞中SOD、CAT、GSH-Px的活力及 MDA的含量:收集各組上清以測LDH活力;消化收集各組細胞，每組加1 ml PBS，采取反復凍融的方法(－80°冰箱15 min，室溫20 min，如此重復5次)，至細胞破碎，內溶物流出，3 000 r·min－1離心 10 min，吸取上清，進行BCA蛋白定量，然后按試劑盒說明書進行 MDA、SOD、CAT、GSH-Px的含量測定;③ 檢測內皮細胞Caspase-3活性:各組細胞經藥物預孵育及H2O2損傷后，消化收集，計數并調整數目為1.5×106個/ml，加 50 μl Cell Lysis Buffer，冰上孵育 10 min，10 000 r·min－1離心1 min轉移上清到新管中，每個樣品加50 μl 2 ×Reaction Buffer(含終濃度 10 mmol·L－1的 DTT)，每個樣品再加 5 μl 4 mmol·L－1的DEVD-pNA(終濃度為 200 μmol·L－1)37℃ 孵育 1～2 h。405 nm分光光度計檢測;④ 檢測總ROS產量:各組細胞經藥物預孵育及H2O2損傷后，Hanks液清洗1次，然后用500 μl carboxy-H2DCFDA(25 μmol·L－1)于 37°C 避光條件下孵育 30 min，置于倒置熒光顯微鏡下觀察;⑤檢測線粒體膜電位:將細胞以1×105個/孔接種于24孔板，各組處理過程同上(加藥及H2O2體積為1 ml)，細胞經藥物預孵育及H2O2損傷后，用 PBS清洗2次。加入10 μl 200 μmol·L－1(終濃度 2 μmol·L－1)JC-1 在避光條件下孵育30 min，再用PBS清洗兩遍后置于顯微鏡下觀察JC-1標記的細胞，呈現綠色或橙紅色。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計軟件包SPSS 11.5進行統(tǒng)計，實驗數據以ˉ±s表示，各組間均數比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 H2O2誘導血管內皮細胞氧化損傷模型的建立 MTT實驗結果顯示:細胞抑制率隨H2O2濃度的升高和作用時間的延長而增加，當150 μmol·L－1H2O2作用 48h 或 300 μmol·L－1H2O2作用 24 h(P＜0.01)時其細胞抑制率達50%左右，為理想造模條件。綜合考慮選用 300 μmol·L－1H2O2作用24 h作為最佳造模條件。結果如Fig 1所示。

Fig 1 Effects of different concentrations and incubation time of H2O2on ECV-304 cells

2.2 紅車軸草總黃酮單獨給藥對血管內皮細胞的影響 紅車軸草總黃酮各劑量組(12.5、25、50 mg·L－1)預孵育4 h后細胞存活率分別為98.42% ±1.7%、97.60%±2.3%和97.71%±1.0%(ˉ±s，n=3)，正常對照組細胞存活率為100%±1.6%±s，n=3)，各給藥組與對照組相比差異沒有顯著性(P＞0.05)，表明紅車軸草總黃酮單給藥對正常內皮細胞ECV-304沒有損傷。

2.3 紅車軸草總黃酮對H2O2損傷血管內皮細胞ECV-304的時效研究 紅車軸草總黃酮預孵育2、4 h 后，加300 μmol·L－1H2O2作用24 h，細胞活力檢測結果顯示，與對照組相比，模型組細胞活力明顯降低(P＜0.01);與模型組相比，槲皮素組和紅車軸草總黃酮(25、50 mg·L－1)組細胞活力明顯提高(P＜0.05，P＜0.01)，且紅車軸草總黃酮對血管內皮細胞的保護作用呈劑量依賴性，與槲皮素組相比差異不具有統(tǒng)計學意義。與藥物預孵育2 h相比，紅車軸草總黃酮及槲皮素預孵育4 h后細胞活力明顯提高(P＜0.01)。因而紅車軸草總黃酮的最佳預孵育時間為4 h。結果如Fig 2所示。

2.4 不同濃度紅車軸草總黃酮對H2O2損傷血管內皮細胞ECV-304形態(tài)學影響 對照組的細胞數目較多，生長狀態(tài)良好，細胞呈多角形或短梭形、飽滿、大小一致;模型組的細胞數目明顯減少，細胞皺縮變圓，間隙增大;與模型組相比，紅車軸草總黃酮各劑量組細胞的形態(tài)均得到不同程度的改善，且呈劑量依賴性，大部分細胞呈多角形或短梭形，細胞間隙小，細胞皺縮明顯減少。表明紅車軸草總黃酮對內皮細胞ECV-304具有良好的保護作用。結果如Fig 3所示。

Fig 2 Red clover flavonoids on endothelial cells in

Fig 3 Effects of RCF on morphological changes inH2O2-treated ECV-304 cells

Tab 1Effects of RCF on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity(ˉ±s，n=3)

Tab 1Effects of RCF on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity(ˉ±s，n=3)

Q30 represents quercetin 30 mg·L－1.##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model.

Group SOD/U·ml－1 MDA/nmol·ml－1protein LDH/U·L－1 CAT/U·mg－1protein GSH-Px/U·mg－1protein Control 17.33+0.092 5.64+0.093 319.4+6.18 28.38+0.23 80.03+0.64 Model 10.74+0.557## 7.60+0.189## 525.34+23.35### 16.42+0.88## 46.55+1.06##RCF(12.5 mg·L－1) 12.66+0.094* 6.89+0.057* 504.97+5.58 19.72+0.41* 51.65+1.53*RCF(25 mg·L －1) 15.41+0.214＊＊ 6.18+0.056＊＊ 464.04+5.01* 22.02+0.89* 60.85+1.24＊＊RCF(50 mg·L－1) 16.55+0.365＊＊ 6.03+0.118＊＊ 408.21+2.60＊＊ 24.43+1.22＊＊ 71.19+0.98＊＊Q(30 mg·L－1) 16.84+0.173＊＊ 5.72+0.131＊＊ 403.69+8.86＊＊ 25.61+1.27＊＊ 69.47+0.61＊＊

Fig 4 Effects of RCF on H2O2-induced ECV-304 cells apoptosis

2.5 紅車軸草總黃酮對H2O2損傷血管內皮細胞ECV-304凋亡情況的影響 H33342及PI染色結果顯示，正常對照組細胞的細胞核呈完整橢圓形，細胞數目多，幾乎無凋亡細胞;與對照組相比，模型組細胞核皺縮變形，細胞數目減少，凋亡細胞明顯增多;與模型組相比，RCF(12.5、25、50 mg·L－1)及槲皮素預孵育組細胞核形態(tài)較完整，細胞數目較多，凋亡細胞較少。且RCF對內皮細胞抗H2O2損傷的作用具有劑量依賴性。結果見Fig 4。統(tǒng)計3次實驗結果，對照組、模型組、RCF 各劑量組(12.5、25、50 mg·L－1)的細胞凋亡率分別為 2.06% ±0.51%、33.92% ±1.35%、12.68% ±1.36、7%.96% ±0.88%和3.54%±0.80%(ˉ±s，n=3)，與對照組相比，模型組細胞凋亡率升高(P＜0.001);與模型組相比，RCF各劑量組的細胞凋亡率降低(P＜0.01，P＜0.001)，說明RCF預孵育可顯著降低細胞凋亡率而較好地保護內皮細胞。

2.6 不同濃度紅車軸草總黃酮對H2O2損傷血管內皮細胞ECV-304酶活力的影響 與正常對照組相比，H2O2模型組加劇細胞膜的脂質過氧化反應，LDH從內皮細胞漏出增加，內源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性降低，MDA含量升高。與H2O2模型組相比，RCF和槲皮素預孵育組LDH漏出量減少，SOD、CAT、GSH-Px活性升高，MDA 含量下降。結果如Tab 1所示。

2.7 不同濃度紅車軸草總黃酮對H2O2損傷血管內皮細胞ECV-304線粒體膜電位的影響 統(tǒng)計3次線粒體膜電位檢測實驗結果，對照組、模型組、RCF 各劑量組(12.5、25、50 mg·L－1)細胞的紅色熒光/綠色熒光的熒光強度比率分別為100% ±9.1%、65% ±6.2%、71% ±8.4%、83% ±9.7%、91%±7.7%(ˉ±s，n=3)。與對照組相比，模型組線粒體膜電位顯著降低(P＜0.01);與模型組相比，紅車軸草總黃酮各劑量組線粒體膜電位升高(P＜0.01)，且紅車軸草總黃酮各劑量組對線粒體膜電位的作用具有劑量依賴性。結果如Fig 5所示。

Fig 5 Effects of RCF on H2O2-induced mitochondrialtransmembrane potential in ECV-304 cells

2.8 紅車軸草總黃酮對內皮細胞內ROS表達水平的影響 根據實驗統(tǒng)計結果得知，對照組、模型組、RCF 各劑量組(12.5、25、50 mg·L－1)細胞中 ROS陽性細胞率分別為10% ±4.1、60% ±8.2、43% ±5.8、34%±6.9和22%±4.0(ˉ±s，n=3)。與對照組相比，模型組中ROS水平升高(P＜0.01);與模型組相比，預孵育不同濃度的紅車軸草總黃酮能夠抑制細胞內由H2O2誘導的ROS高表達，使ROS水平降低(P＜0.01)，且呈劑量依賴性。結果如Fig 6所示。

Fig 6 Effects of RCF on intracellular ROSproduction in ECV-304 cells

2.9 紅車軸草總黃酮對H2O2損傷血管內皮細胞ECV-304 caspase-3活性的影響 Caspase-3活性的結果顯示，與對照組相比，模型組中活化的Caspase-3水平升高(P＜0.001);與模型組相比，紅車軸草總黃酮(25、50 mg·L－1)預孵育組的 Caspase-3水平均有不同程度的降低，且紅車軸草總黃酮對Caspase-3活性降低的作用具有劑量依賴性。實驗結果表明，紅車軸草總黃酮抗凋亡作用可能與其調節(jié)Caspase級聯反應的激活有關。結果如Fig 7所示。

3 討論

血管內皮細胞的凋亡與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關，是動脈粥樣硬化的始動因素［8］。活性氧自由基是內皮細胞損傷的主要原因之一。H2O2是機體產生的活性氧，在過氧化條件下能分解成氧自由基，通過對生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細胞損傷，最終形成動脈粥樣硬化斑塊。據此本實驗建立了以H2O2為刺激因素的內皮細胞氧化損傷模型。

Fig 7 Caspase-3 activity(fold increase)of endothelial cells in different groups(ˉ ± s ，n=3)

脂質過氧化對內皮細胞有明顯的損傷作用，因此，具有抗脂質過氧化能力的藥物，也可達到防治動脈粥樣硬化的目的。LDH是胞內酶，漏出量的多少可反映細胞膜的受損程度;內皮細胞MDA量的變化可反映內皮細胞產生ROS的情況［9］。同時細胞內存在一個包括SOD、CAT、GSH-Px等酶在內的內源性抗氧化體系，他們通過代謝轉化來清除ROS。GSH-Px氧化還原循環(huán)是內皮細胞中最重要的H2O2-解毒體系［10］。本實驗發(fā)現，與對照組相比，H2O2模型組內皮細胞的LDH漏出量和MDA的含量顯著增加，而抗氧化酶(SOD、MDA、GSH-Px)的活性顯著降低，不能清除瞬間產生的大量的ROS，從而導致H2O2模型組的ROS水平升高，這一點與檢測ROS的實驗結果一致。而紅車軸草總黃酮的預作用可抑制H2O2的損傷作用，使LDH漏出量和MDA含量降低，內皮細胞中SOD、CAT和GSH-Px的活力增強，胞內ROS的水平降低，提示紅車軸草總黃酮可能是通過增強脂質抗氧化酶活性而拮抗氧化應激誘導的內皮細胞損傷。

線粒體在內皮細胞凋亡中發(fā)揮著核心的作用［11］。在線粒體調控的凋亡過程中最早期的變化就是線粒體膜的改變，這表現為線粒體跨膜電位的降低和線粒體膜通透性的改變［12］。本實驗采用JC-1熒光探針法檢測細胞的線粒體膜電位，結果顯示，模型組線粒體膜電位顯著降低，細胞凋亡比例顯著升高，這與模型組的PI染色凋亡統(tǒng)計結果一致。而紅車軸草總黃酮預處理組可抑制H2O2損傷引起的膜電位的降低，細胞凋亡比例降低，這種保護作用在RCF50 mg·L－1時最明顯，且具有劑量依賴性。結果表明紅車軸草總黃酮可能通過穩(wěn)定線粒體膜電位來發(fā)揮保護內皮的作用。

氧化應激可誘發(fā)Caspase-3及其他許多不同激酶的活化［13］，而Caspase-3是導致凋亡的最重要的凋亡執(zhí)行蛋白酶［14］。有研究表明，Caspase-3活化與H2O2誘導的內皮細胞的凋亡相關［15］。本實驗中，模型組Caspase-3活性顯著升高，細胞大量凋亡，而紅車軸草總黃酮處理組可抑制H2O2引起的Caspase-3活性的升高，劑量依賴性減少凋亡細胞數目。結果表明紅車軸草總黃酮通過抑制Caspase-3的活化而抑制細胞凋亡。

總之，本實驗結果表明H2O2可誘發(fā)ECV-304細胞產生凋亡，而紅車軸草總黃酮預處理可抑制細胞凋亡，保護內皮細胞。紅車軸草總黃酮的這種保護作用可能與其增強體內抗氧化性應激系統(tǒng)、清除氧自由基、抗脂質過氧化、降低Caspase-3的活性及穩(wěn)定線粒體膜電位有關。

近年來研究表明，血管內皮細胞功能損害是心血管疾病早期的重要特征，是促進動脈粥樣硬化最重要的始動因素［16］，因而尋找抗內皮細胞凋亡和保護內皮細胞功能的藥物是防治心血管疾病的重要思路。本實驗雖然對紅車軸草總黃酮對內皮細胞的保護作用及其機制做了初步探究，但仍需進行大量的體內和體外實驗，進一步深入研究藥物作用機制，才能為其在臨床的開發(fā)應用提供可靠的科學依據，并有望將其開發(fā)成新的臨床治療心血管疾病的藥物。

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