李 嬛，吳 麗，李 杰，郭 輝，劉 曉，蔡 皓，蔡寶昌

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210046;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210029;3.南京海昌中藥集團(tuán)，江蘇南京 210061;4.武漢名老中醫(yī)會(huì)診中心 湖北武漢 430000

寒積里實(shí)證史載于《金匱要略·腹?jié)M寒疝宿食病脈證治第十》篇，原文云:“脅下偏痛，發(fā)熱，其脈緊弦，此寒也，以溫藥下之，宜大黃附子湯?！迸R床表現(xiàn)為脅下偏痛，發(fā)熱，手足厥冷，脈緊弦。蓋陰寒積聚，橫陳一處，雖見發(fā)熱，亦是陽氣被郁，難以輸布。此則非溫陽不能散其寒，非瀉下不能去其積也。故仲師擬大黃附子湯以附子、細(xì)辛之辛溫大熱善走者溫散之，而后用大黃得以通泄其積滯也，使得邪氣終有出路。目前沒有寒積里實(shí)證模型的報(bào)道，因此筆者對(duì)該模型的研究報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD大鼠，體重(220+20 g)，♀♂各半，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào):SCXK(蘇 )2008－0004。

1.2 試劑 高嶺土，江西景德鎮(zhèn)雅致江南廠家;胃動(dòng)素(MTL)，生產(chǎn)批號(hào):YS02032B;P物質(zhì) (SP)，生產(chǎn)批號(hào):YS01985B;血管活性腸肽(VIP)，生產(chǎn)批號(hào):YS01986B;環(huán)腺苷酸 (cAMP)，生產(chǎn)批號(hào):YS02090B、環(huán)鳥苷酸 (cGMP)，生產(chǎn)批號(hào):YS01568B，購(gòu)自上海雅吉生物公司。

1.3 藥物 大黃來自蓼科植物掌葉大黃(RADIX ET RHIZOMA RHEI)的根和根莖 (生產(chǎn)批號(hào):001004495);附子來自毛茛科植物烏頭(RADIX ACONITI LATERALIS PREPAR ATA)的子根加工品(生產(chǎn)批號(hào):101232825)，細(xì)辛來自馬兜鈴科細(xì)辛(HERBA ASARI)的根 (生產(chǎn)批號(hào):101002533)，均購(gòu)自北京同仁堂公司。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)蔡皓老師鑒定，符合《中華人名共和國(guó)藥典》(2010年版)項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。稱取大黃－附子－細(xì)辛 (3∶4∶1)藥材共24 g，加入10倍量體積水煮30分鐘，紗布過濾得濾液。1.4 儀器 酶標(biāo)儀:芬蘭(Labsystems Multiskan MS)352型，洗板機(jī):芬蘭 (Thermo Labsystems)AC8，離心機(jī):微量高速離心機(jī)TG16W，培養(yǎng)箱:隔水式恒溫培養(yǎng)箱GNP-9080型，紅外測(cè)溫儀:Fluke 566。

2 方法

2.1 SD大鼠寒積里實(shí)證模型的造摸方法 大鼠每天上午9:00時(shí)灌胃給予2℃冰水2 ml·100 g－1，6 h后，每鼠按2.5 ml·100 g－1體重灌胃給予 2 g·ml－1的高嶺土混懸液，空白組每天同一時(shí)間灌胃相應(yīng)體積蒸餾水，連續(xù)7 d。

2.2 SD大鼠寒積里實(shí)證模型的尾部溫度測(cè)定和排便實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用大鼠共60只，取SD大鼠20只，按體重隨機(jī)分為2組，每組10只，即空白對(duì)照組、模型組。模型組動(dòng)物如2.1方法造模，末次灌胃后，用紅外測(cè)溫儀快速測(cè)定各組大鼠尾部溫度后，給予活性炭水，隨后立即把大鼠逐只置于代謝籠內(nèi)進(jìn)行觀察，動(dòng)物禁食不禁水，記錄大鼠首粒排黑糞時(shí)間和6 h內(nèi)排黑糞粒數(shù)。結(jié)果見Tab 1，2。

Tab 1Effect on excretion of rats(±s，n=10)

Tab 1Effect on excretion of rats(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Time of stool excretion/min Number of stool excretion/granules Control 22.94 ±8.52 12.9 ±3.0 Model 165.44 ±74.63＊＊ 4.92 ±2.6＊＊Therapeutic 43.92 ±18.26 16.0 ±3.2

2.3 SD大鼠寒積里實(shí)證模型的客觀生物指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)另取SD大鼠20只，分組同2.2項(xiàng)下方法，末次灌胃1 h后，眼眶取血 2 ml，12 000 r·min－1，離心 1 min 取血清，按試劑盒說明書操作測(cè)定胃動(dòng)素 (MTL)、P物質(zhì) (SP)、血管活性腸肽(VIP)，環(huán)腺苷酸 (cAMP)，環(huán)鳥苷酸 (cGMP)含量。結(jié)果見Tab 3。

2.4 SD大鼠寒積里實(shí)證模型的反證治療 另取SD大鼠20只，隨機(jī)分為2組，每組10只。按照2.1項(xiàng)下方法造摸，末次灌胃6 h后給予大黃附子湯(2.5 g· kg－1)，一組大鼠按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行尾部溫度測(cè)定和排便實(shí)驗(yàn)，一組大鼠按2.3項(xiàng)下進(jìn)行客觀生物指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見Tab 1，2，3。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)均采用±s表示。

Tab 2Effect on temperature of rats tail(±s，n=10)

Tab 2Effect on temperature of rats tail(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group Temperature of rats tail/℃Control 17.15 ±1.13 Model 15.67 ±0.45＊＊Therapeutic 16.8 ±0.62

Tab 3 Influence on gastrointestinal hormones and neurotransmitters in rats( ± s，n=10)

Tab 3 Influence on gastrointestinal hormones and neurotransmitters in rats( ± s，n=10)

*P＜0.05 vs control group

Groups MTL VIP SP cAMP/cGMP Control 366.65±88.49 109.95 ±31.28 189.12±37.20 0.14 ±0.11 Model 283.50±75.69* 101.45 ±16.41 121.30±62.48* 0.09 ±0.07 Therapeutic 284.61±145.94 119.96 ±50.07 156.24±37.53 0.15 ±0.03

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 模型一般生物學(xué)特征 模型組動(dòng)物普遍于3～4 d時(shí)出現(xiàn)排便粒數(shù)減少，大便干燥，攝食量減少，反應(yīng)遲緩，抓取時(shí)掙扎無力，觸之覺披毛松弛。

3.2 SD大鼠寒積里實(shí)證模型的尾部溫度測(cè)定和排便實(shí)驗(yàn)由Tab1，2可以看出，造模后，與空白對(duì)照組比較:模型組首粒排便時(shí)間明顯延遲，6 h內(nèi)排便粒數(shù)明顯減少;尾部溫度明顯下降。

3.3 SD大鼠寒積里實(shí)證模型的客觀生物指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)由Tab 3可以看出，與空白對(duì)照組比較:模型組動(dòng)物胃動(dòng)素，P物質(zhì)含量明顯降低，血管活性腸肽含量和cAMP/cGMP有降低趨勢(shì)。

3.4 SD大鼠寒積里實(shí)證模型的反證治療 由Tab1～3可以看出，大黃附子湯使得寒積里實(shí)證模型大鼠的首粒排便時(shí)間提前，排便粒數(shù)增加，尾部溫度升高，使 P物質(zhì)，血管活性腸肽含量，cAMP/cGMP趨于正常，但是對(duì)胃動(dòng)素的影響不大。

4 對(duì)SD大鼠寒積里實(shí)證模型的評(píng)價(jià)

4.1 對(duì)造模因素的評(píng)價(jià) 證候造模因素有兩類，一類相同于臨床病因，一類是能導(dǎo)致證候病理的非自然因素。本實(shí)驗(yàn)選擇采用李杰醫(yī)生提供的理論，選擇相同于臨床病因的因素進(jìn)行造模。寒積里實(shí)證在《金匱要略》中的描述為:脅下偏痛，發(fā)熱，脈緊弦，寒積之因乃是寒邪直中太陰陽明所致，首先通過灌胃給予大鼠一定體積的冰水造成中寒邪直中臟腑，陽氣溫運(yùn)不開，寒凝形成實(shí)證。里實(shí)可以指代腸的狀態(tài)，里實(shí)即便秘。而古人在饑餓狀態(tài)下會(huì)食用高嶺土充饑，繼而引發(fā)便秘。因此我們選擇灌胃給予大鼠高嶺土來復(fù)制里實(shí)的模型。該模型復(fù)制的注意點(diǎn)是首先模擬形成寒實(shí)證，繼而可形成里實(shí)證。

4.2 對(duì)癥狀診斷的評(píng)價(jià) 鑒于動(dòng)物模型是在動(dòng)物體上模擬與人類疾病相似的臨床征候，因此動(dòng)物模型的診斷依據(jù)必須與臨床病征候的診斷依據(jù)相一致。本實(shí)驗(yàn)選用觀察模型動(dòng)物的一般狀態(tài)、排便量、首粒排便時(shí)間、尾部溫度作為寒積里實(shí)證動(dòng)物模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中大鼠尾部溫度能夠靈敏的反應(yīng)寒證信息［1］。結(jié)果表明動(dòng)物的首粒排便時(shí)間延長(zhǎng)，排便粒數(shù)降低，尾部溫度下降，可以判斷此模型為寒積里實(shí)證模型。

4.3 對(duì)客觀指標(biāo)的評(píng)價(jià) 鑒于寒積里實(shí)與寒證及胃腸運(yùn)動(dòng)功能密切相關(guān)，故選擇與寒證和胃腸運(yùn)動(dòng)功能密切相關(guān)的客觀指標(biāo)。cAMP/cGMP，胃腸激素(MTL，SP)和腸神經(jīng)遞質(zhì)(VIP)，來判斷寒積里實(shí)動(dòng)物模型成功與否［2］。

4.4 對(duì)大黃附子湯反證治療的評(píng)價(jià) 在證候模型上，由于證狀觀察受一定限制，故治療反證重要性提高。選取治療寒積里實(shí)證的對(duì)應(yīng)復(fù)方大黃附子湯作為反證治療的藥物，可以看出大黃附子湯使寒積里實(shí)證模型大鼠的首粒排便時(shí)間和排便粒數(shù)增加，尾部溫度升高。P物質(zhì)和血管活性腸肽(VIP)含量升高，但對(duì)胃動(dòng)素的影響不大。

4.5 對(duì)新建的SD大鼠寒積里實(shí)證模型的評(píng)價(jià) 遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型設(shè)計(jì)相似性、重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)化、實(shí)用性及經(jīng)濟(jì)性等原則，本實(shí)驗(yàn)采用冰水加高嶺土灌胃方法建立SD大鼠寒積里實(shí)模型，該模型在一定程度上模擬了中醫(yī)臨床寒積里實(shí)證的癥狀特點(diǎn)，模型的生物學(xué)特征、客觀指標(biāo)的檢測(cè)經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。該模型具有重復(fù)性好，復(fù)制簡(jiǎn)單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。

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