范曉云，汪 浩，徐 軻，唐 偉，陸兆雙

(1.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年呼吸內科，安徽合肥 230022;2.安徽醫(yī)科大學老年病研究所，安徽合肥 230022)

哮喘是一種由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾?。?－3］。嗜酸性粒細胞(EOS)是氣道慢性炎癥的主要效應細胞，IL-8則是來源于多種細胞且對炎性細胞具有趨化作用的細胞因子，可誘導中性粒細胞、EOS遷徙和活化［4］，參與哮喘炎癥和變態(tài)反應的發(fā)生。糖皮質激素仍是目前治療哮喘最有效的藥物，可抑制趨化因子對中性粒細胞、嗜酸粒細胞等炎性細胞的趨化作用和炎癥因子本身來減輕氣道炎癥，降低氣道高反應。本研究通過建立哮喘大鼠動物模型，探討IL-8在哮喘炎癥中作用和抗炎藥物DXM對其影響，為將來把趨化因子作為設計哮喘藥物的新靶點提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康♂SD大鼠30只，體質量180～220 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑及試劑盒 卵白蛋白(OVA):Sigma公司;IL-8免疫組化試劑盒:美國ZYMED公司;Trizol試劑:美國Invitrogen公司;反轉錄聚合酶鏈反應試劑盒:日本Takara公司。DXM:山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 30只健康♂SD大鼠隨機分為正常組、哮喘組、DXM干預組。

1.2.2 哮喘大鼠模型建立(致敏和激發(fā)) 參照文獻復制哮喘大鼠模型［5］，哮喘組:d 1和d 8分別給予大鼠腹腔注射 OVA 1 mg和Al(OH)3100 mg無菌混懸液致敏。2周后將已致敏大鼠置于霧化箱中，用1%OVA霧化吸入激發(fā)，1次/天×30 min，連續(xù)7 d。哮喘大鼠表現為易激怒、呼吸急促、鼻翼煽動、進食差、大小便失禁等癥狀。DXM干預組:致敏與激發(fā)同哮喘組，不同的是每日激發(fā)前半小時予DXM 1 mg·kg－1腹腔注射。正常組:致敏與激發(fā)階段OVA和DXM均用生理鹽水代替。

1.2.3 標本采集和處理 各組大鼠均于末次激發(fā)24 h內，以7%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，統(tǒng)一切取左肺肺組織10%甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋制作病理切片，肺組織病理切片染色證實有大量嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等炎癥細胞浸潤等表示大鼠哮喘模型制備成功。檢測肺組織中IL-8蛋白表達。取右肺組織立即存放于 －80℃冰箱保存，供RTPCR使用。

1.2.4 肺組織病理觀察 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，行肺組織蘇木精－伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織病理學變化。

1.2.5 大鼠肺組織IL-8蛋白表達檢測 SP法參照二抗試劑盒說明書進行:切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復，IL-8一抗稀釋度為1∶350，DAB顯色，蘇木精復染。陰性對照以PBS替代一抗。選擇切片中結構較完整的支氣管，判斷標準:陽性結果細胞質著色呈棕黃色。每張切片隨機選擇5個高倍鏡下支氣管切面(×400)，應用捷達801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)測定陽性部位的平均光密度值(AOD)，代表陽性部位的蛋白表達水平。

1.2.6 大鼠肺組織IL-8基因表達檢測 TRIzol提取總RNA并以260/280比值鑒定純度，一步法進行逆轉錄擴增。根據GenBank查找IL-8核苷酸序列設計引物，由上海生物工程技術服務有限公司合成。IL-8:(323 bp)上游:5'TGG TCT CAG CCA CCC GC3'，下游:5'CCC TGT GGC TTG GCG G 3';β-actin:(191 bp)上游:5'AAC GAC CCC TTC ATT GAC 3'，下游:5'TCC ACG ACA TAC TCA GCA 3'。擴增條件:94℃變性5 min，然后按以下條件進行:94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火40 s(IL-8)和55℃ 40s(β-actin)，72℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，72℃延伸10 min。產物經瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后于凝膠成像儀上拍照，圖像分析系統(tǒng)測定電泳條帶的以目的基因IL-8和內參β－actin的積分光密度值(IOD)的比值表示目的基因的相對量。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數據采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件分析，數據以±s表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較，方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett's T3檢驗。

Fig 1 HE-stained lung tissue from rat of each group

2 結果

2.1 肺組織病理改變 正常對照組(Fig 1A)肺組織結構正常，肺泡腔內有個別炎癥細胞滲出，支氣管壁及周圍可見極少量炎癥細胞。哮喘組(Fig 1B)肺組織結構輕度破壞，支氣管上皮中度變性、壞死、脫落，支氣管壁明顯增厚，支氣管壁及周圍、血管周圍可見大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔內有較多的炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增厚，組織黏膜充血水腫。地塞米松組(Fig C)肺組織結構正常，肺泡腔及支氣管周圍的炎癥改變較哮喘組明顯減輕。

Fig 2 RT-PCR electrophoretic analysis of IL-8 gene expression

2.2 糖皮質激素對大鼠肺組織IL-8基因表達的影響 3組間肺組織IL-8 mRNA表達水平有明顯差異性(P＜0.01);正常組中大鼠肺組織IL-8 mRNA少量表達，在323 bp處可見陽性條帶，與設計片段大小符合(Fig 2)。與正常組相比，哮喘組大鼠肺組織IL-8 mRNA表達明顯增高，差異具有顯著性(P＜0.01)，與哮喘組比較，DXM治療后其表達均有所下降(P＜0.01)(Fig 3)。

Fig 3 Comparison of IL-8 mRNA(IOD)levels of lung tissue in three groups

2.3 糖皮質激素對大鼠肺組織IL-8蛋白表達的影響 IL-8主要表達于支氣管上皮細胞、支氣管周圍的淋巴濾泡炎性細胞及肺組織的單核巨噬細胞胞質中和肺泡間質細胞中，呈棕黃色顆?；蚍伍g質黃染，哮喘組表達最強，其次DXM組，正常組表達最弱(見Fig 4)。正常組的IL-8的表達與其他兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，與哮喘組比較，DXM組的IL-8的表達減少，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

Fig 4 Expression of IL-8 in the lung section of rat of each group

3 討論

支氣管哮喘是當今世界最常見的慢性疾病之一。特別是近20年來，哮喘的發(fā)病率增加，已將其列入二十一世紀急需防治的重大疾病之一。目前對哮喘的發(fā)生普遍認為是氣道內存在廣泛炎癥，主要包括氣道黏膜充血水腫明顯、氣道上皮損傷脫落、氣道內黏液分泌增多及黏液栓的形成、上皮下可見嗜酸粒細胞、肥大細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等多種炎癥細胞浸潤［6－7］。其發(fā)病機制復雜，至今尚未完全闡明。通過對氣道炎癥的研究，發(fā)現哮喘是一種主要由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞和多種細胞因子共同參與的非特異性慢性氣道炎癥［8］。

其中，趨化因子引起中性粒細胞、嗜酸性粒細胞在氣道中的遷移和功能活化在哮喘的發(fā)生中具有極其重要的作用［9－10］。趨化因子的本質是一類結構、功能相似，分子量在8～10 ku的小分子蛋白［11］。IL-8作為哮喘發(fā)病相關細胞因子網絡的重要成員，是趨向性細胞因子超家族中的一員，具有趨化中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、單核細胞的作用，誘導中性粒細胞變形、激活，使其定向游走，促進細胞內游離鈣離子濃度一過性升高，誘導其脫顆粒、釋放蛋白水解酶和氧自由基、花生四烯酸等一系列炎性介質，誘導黏附分子的表達，引起呼吸爆發(fā)［12］，從而促進炎癥反應［13］。同時，IL-8趨化并激活嗜酸性粒細胞合成與釋放陽離子蛋白，并能引起氣道黏膜下微血管通透性增加、腺體分泌亢進、平滑肌收縮及氣道上皮細胞脫落，參與哮喘急性發(fā)作期和非急性發(fā)作期的炎癥反應，屬調節(jié)哮喘氣道炎癥的上調因子;我們前期利用陽離子蛋白類似物多聚左旋精氨酸作用于氣道上皮細胞發(fā)現細胞上清液中IL-8分泌增加［14］，說明IL-8和陽離子蛋白相互作用，進一步加重氣道炎癥。IL-8可促使嗜堿性粒細胞趨化，并在IL－3存在情況下引起嗜堿性粒細胞脫顆粒，釋放組胺及白三烯，介導不依賴于IgE的變態(tài)反應，從而在遲發(fā)性哮喘中也起一定的作用。

本課題組前期研究發(fā)現哮喘大鼠模型血清、肺泡灌洗液中IL-8水平明顯高于正常組［15］，我們通過RT-PCR和免疫組化半定量法對大鼠肺組織IL-8基因和蛋白進行檢測，又發(fā)現哮喘組IL-8基因和蛋白表達顯著高于對照組，動物實驗進一步證實IL-8參與了支氣管哮喘的發(fā)作，這一結果與有關哮喘患者的報道結果相符［13］，因此可以看出IL-8參與哮喘的炎癥過程，故IL-8水平的監(jiān)測可作為反映支氣管哮喘氣道炎癥和觀察病情變化的重要指標。Xatzipsalti等［16］在哮喘患者支氣管上皮細胞中發(fā)現IL-8基因表達及其分泌的IL-8增加。IL-8可以通過誘導中性粒細胞、嗜酸性粒細胞遷徙和活化，引起中性粒細胞向炎癥部位聚集而產生炎癥介質，同時，聚集至氣道的中性粒細胞及嗜酸性粒細胞又能分泌IL-8，形成循環(huán)通路，導致和加重哮喘的發(fā)作［17］，由此可見，IL-8在哮喘的發(fā)病過程中起著十分重要的作用。

目前，糖皮質激素仍是指南推薦治療哮喘的首選藥物，實驗證實了經DXM干預后肺組織中IL-8基因和蛋白表達水平明顯低于哮喘組，而高于正常組水平，與國內外研究結果相符［18－20］。DXM 抑制IL-8介導的炎癥反應，使嗜酸性粒細胞、中性粒細胞趨化、聚集過程受阻而起到很好的抗炎作用。由此可以推測糖皮質激素DXM可能是通過下調趨化因子IL-8表達，從而減弱對嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等炎癥細胞的趨化、激活、聚集作用從而減輕氣道炎癥反應，最終達到治療哮喘的目的。

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