劉 勇，余艷榮，彭維杰，況海斌，徐 宏，宋培源，羅 丹

縫隙連接(gap junction，GJ)是由相鄰細(xì)胞膜上的縫隙連接蛋白構(gòu)成的細(xì)胞間親水性通道。相鄰細(xì)胞通過(guò)GJ進(jìn)行信息和物質(zhì)能量的交流，即縫隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction inter-cellular communication，GJIC)，在維持細(xì)胞新陳代謝、調(diào)控增殖和分化等過(guò)程中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白(connexin，Cx)大約有20多種，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Cx37、Cx40和 Cx43［1］。近年來(lái)的大量研究提示，血管壁Cx的類型、數(shù)目和空間分布的改變所致的GJIC功能障礙參與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生發(fā)展［2－3］。其中，Cx37 和 Cx40 被認(rèn)為具有抗AS作用，在Apoe－/－小鼠模型，敲除Cx37和Cx40基因可加速高膽固醇飲食誘發(fā)的AS斑塊形成［4－5］?？笰S藥物他汀類可恢復(fù)人類一級(jí)血管中Cx37的表達(dá)，提示改善GJIC可能作為他汀類藥物的非降脂抗AS作用機(jī)制［6］。

吳茱萸次堿(rutaecarpine，Rut)為傳統(tǒng)中藥吳茱萸的主要活性成分，具有廣泛的心血管保護(hù)效應(yīng)［7］。前期大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明，Rut的主要心血管效應(yīng)(如對(duì)豚鼠心房的正性肌力和正性頻率作用，舒血管和降壓作用，以及心肌保護(hù)作用等等)均與激活辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)有關(guān)［8］。TRPV1屬瞬時(shí)感受器電位離子通道(TRP)超家族成員，廣泛分布于感覺(jué)神經(jīng)元末梢，我們已確證人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)膜表面也存在TRPV1［9］。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)［10］，Rut可抑制AS因子LIGHT誘導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移，提示其具有潛在的抗AS效應(yīng)。已知血管內(nèi)皮損傷是AS血管病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)，保護(hù)內(nèi)皮是抗AS的重要策略。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Rut明顯降低Ox-LDL的主要活性成分溶血性磷脂酰膽堿(lysopbosphatidylcholine，LPC)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，預(yù)先給予TRPV1競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑CAPZ可以取消其效應(yīng)，提示Rut通過(guò)激活TRPV1發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)［11］。本實(shí)驗(yàn)在LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷模型進(jìn)一步確定Rut的內(nèi)皮保護(hù)作用，觀察其對(duì)內(nèi)皮Cx37、Cx40和GJIC的影響，并探討Rut對(duì)GJ的調(diào)控機(jī)制是否涉及TRPV1途徑。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所提供，源自ATCC細(xì)胞庫(kù))，人單核細(xì)胞株THP-1(中科院上海生化細(xì)胞所提供，源自ATCC細(xì)胞庫(kù));吳茱萸次堿(純度＞99%，上海君拓生物技術(shù)有限公司)，LPC、Lucifer Yellow(熒光黃染料)、CAPZ(Sigma，USA)，SYBR@Premix EX TaqTM(寶生物工程有限公司)，TransZol細(xì)胞裂解液，RT-PCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，兔抗人 Cx37和兔抗人 Cx40抗體(ab83788 和 ab38580，Abcam)，Goat anti-rabbit IgG-(H+L)/HRP(北京中杉金橋有限公司)，NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器 ABI 7500熒光定量 PCR儀(ABI，USA)，流式細(xì)胞儀(FCM)(Becton Dickinson，USA)，熒光顯微鏡(Olympus，日本)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-RAD，USA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 HUVEC-12解凍復(fù)蘇后，取3～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞稀釋至1×108·L－1后接種至96孔板或6孔板中，待細(xì)胞80%融合時(shí)換成含1%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，然后分別加入不同的處理因素:①Control組:培養(yǎng)基中不加任何處理因素;②LPC損傷組:加入LPC(終濃度為10 mg·L－1)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h;③－⑤+Rut(高、中、低)保護(hù)組:分別加入終濃度為 1.0、0.3、0.1 μmol·L－1的吳茱萸次堿孵育內(nèi)皮細(xì)胞10 min后，加入LPC繼續(xù)孵育24 h;⑥+CAPZ+Rut(H)組:用 TRPV1受體阻斷劑 CAPZ(10 μmol·L－1)預(yù)先處理細(xì)胞10 min后，加入?yún)擒镙谴螇A(1.0 μmol·L－1)孵育內(nèi)皮細(xì)胞 10 min，然后加入LPC繼續(xù)孵育24 h。

1.4 Real-time PCR 檢測(cè) Cx37、Cx40 mRNA 的表達(dá)(SYBR Green染料法)Trizol提取內(nèi)皮細(xì)胞總RNA，按RT-PCR試劑盒方法逆轉(zhuǎn)錄。所用引物和擴(kuò)增產(chǎn)物如下:Cx37(150bp):5'-GGCACCTATGTCGCCAGTG-3'(上游)和5'-GCGAGAGACAAAGCAGTCCA-3'(下游);Cx40(137bp):5'-TCCTGGAGGAAGTACACAAGC-3'(上游)和5'-ATCACACCGGAAATCAGCCTG-3'(下游);GAPDH(102bp):5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'(上游)和 5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'(下游)。每 20 μl PCR 反應(yīng)體系中含:cDNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq(2 × )10 μl，上下游引物各 0.4 μl，ROX Reference DyeⅡ(50 × )0.4 μl，RNase-free Water 6.8 μl。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性95℃ 30 s，變性95℃，5 s，退火60℃ 34 s，40 循環(huán)。以 2－△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.5 Western blot檢測(cè) Cx37、Cx40 的蛋白水平提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(1 ∶1 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，TBST室溫漂洗3次后加入二抗(1∶5 000)，漂洗后將膜放入裝有ECL混合液的封閉袋中置于X線暗盒中，壓片曝光1～20 min，顯影、定影。將X線片掃描，使用Quantity One分析軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin的密度為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)密度，結(jié)果表示為實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于正常對(duì)照組相對(duì)密度的倍數(shù)差異。

1.6 劃痕負(fù)載試驗(yàn)測(cè)定 GJIC功能 Lucifer Yellow(熒光黃)染料不能通過(guò)正常細(xì)胞細(xì)胞膜，只能在劃傷瞬間進(jìn)入被劃傷細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)縫隙連接傳遞給相鄰正常細(xì)胞，故熒光黃在細(xì)胞間傳遞的范圍可反映GJIC功能。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1 ml 0.5 g·L－1的LY熒光染料，在培養(yǎng)皿細(xì)胞表層劃3道劃痕，室溫孵育3 min后吸出染料，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察染料在劃痕垂直方向上的遷移范圍。

1.7 MTT水平檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞活力 將內(nèi)皮細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μl，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(只加入等體積的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入 MTT 溶液(5 g·L－1)20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處各孔的吸光度值。細(xì)胞活力(OD)=樣品吸光度值－調(diào)零孔吸光度值。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平的測(cè)定 吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，2 000×g離心5 min，留取上清液，按試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)。硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量，NO(μmol·L－1)=樣品消光值 ÷ 標(biāo)準(zhǔn)管消光值×100。

1.9 細(xì)胞ROS生成 (流式探針?lè)?DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可被胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。細(xì)胞內(nèi)的 ROS可進(jìn)一步氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF，檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。制備單細(xì)胞懸液，洗滌后以 500 μl培養(yǎng)基重懸，加入 10 μmol·L－1DCFHDA熒光探針，37℃避光孵育20 min，洗滌細(xì)胞后用300 μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.10 內(nèi)皮－單核細(xì)胞黏附率的檢測(cè) 單核細(xì)胞THP-1稀釋至109·L－1，加入6孔板的內(nèi)皮細(xì)胞中(每孔1 ml)，37℃孵育30 min后用PBS洗滌3遍，去除未黏附細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)黏附的單核細(xì)胞數(shù)。倒置高倍顯微鏡下每孔隨機(jī)選擇6個(gè)視野，計(jì)數(shù)黏附的單核細(xì)胞數(shù)目。

2 結(jié)果

2.1 吳茱萸次堿對(duì)LPC損傷內(nèi)皮細(xì)胞中Cx37和Cx40 mRNA水平的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示(Fig 1)，LPC孵育內(nèi)皮細(xì)胞后，Cx37和Cx40 mRNA的水平均明顯下降，不同濃度的吳茱萸次堿可不同程度地上調(diào)兩者水平，預(yù)先給予TRPV1受體阻斷劑CAPZ(10 μmol·L－1)可取消吳茱萸次堿的這一效應(yīng)(P＜0.01)。

Fig 1 Effect of Rut on Cx37 and Cx40 mRNA expression in LPC treated HUVECs(Cx37 and Cx40 mRNA was detected by Real-time PCR)(ˉ ± s，n=3)

2.2 吳茱萸次堿對(duì)LPC損傷內(nèi)皮細(xì)胞中Cx37和Cx40蛋白水平表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果如Fig 2所示，LPC明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞Cx37和Cx40的蛋白表達(dá)，吳茱萸次堿則可恢復(fù)兩者的表達(dá)水平，該效應(yīng)可被CAPZ所阻斷(P＜0.01)。

2.3 吳茱萸次堿對(duì)LPC誘導(dǎo)GJIC功能障礙的影響 熒光黃染料沿劃痕處的垂直傳遞范圍可反映GJIC功能，如Fig 3所示，LPC明顯抑制熒光黃染料沿劃痕處的垂直傳遞，吳茱萸次堿(1.0 μmol·L－1)能在一定程度上恢復(fù)LPC所致的GJIC功能障礙，該效應(yīng)可被CAPZ所阻斷。

Fig 2 Effect of Rut on level of Cx37 and Cx40 proteinin LPC treated HUVECs(ˉ±s，n=3)

Fig 3 Effect of Rut on function of GJICin LPC treated HUVECs

2.4 吳茱萸次堿對(duì)LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響 如Tab 1所示，LPC明顯降低內(nèi)皮細(xì)胞的活力，吳茱萸次堿(1.0、0.3、0.1 μmol·L－1)能劑量依賴性地抑制LPC所致的內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，預(yù)先給予CAPZ可取消這種保護(hù)作用(P＜0.01)。

2.5 吳茱萸次堿對(duì)LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞NO和ROS生成的影響 如Tab 1所示，LPC可抑制內(nèi)皮保護(hù)因子NO的釋放，促進(jìn)氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS的生成(P＜0.01)。不同劑量的吳茱萸次堿能劑量依賴性地促進(jìn)NO生成，降低ROS的水平。這些內(nèi)皮保護(hù)效應(yīng)均可被CAPZ所阻斷(P＜0.01)。

2.6 吳茱萸次堿對(duì)LPC誘導(dǎo)內(nèi)皮－單核細(xì)胞黏附的影響 如Tab 1所示，正常內(nèi)皮細(xì)胞可黏附少量單核細(xì)胞(108±5)個(gè)，LPC孵育內(nèi)皮細(xì)胞可明顯增加單核細(xì)胞黏附數(shù)量(271±8)個(gè)，不同濃度的吳茱萸次堿(1.0、0.3、0.1 μmol·L－1)均能明顯抑制內(nèi)皮－單核細(xì)胞黏附(P＜0.01)，該效應(yīng)均可被CAPZ所取消(P＜0.01)。

Tab 1 Effect of Rut on endothelial cell damage induced by LPC(ˉ±s，n=6)

Tab 1 Effect of Rut on endothelial cell damage induced by LPC(ˉ±s，n=6)

##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs LPC;++P＜0.01 vs+Rut(H).

Group Cell viability(OD)NO/μmol·L －1 ROS(arbitrary units)Monocyte adhension(cell number)Control 0.89 ±0.11 55.88 ±9.12 564.32 ±18.50 108±5 LPC 0.43 ±0.06## 32.40 ±7.06## 787.21 ±23.31## 271±8##+Rut(H) 0.75±0.08＊＊ 53.58±9.89＊＊ 397.71±12.12＊＊ 110±4＊＊+Rut(M) 0.65±0.13* 48.53±6.13＊＊ 548.82±21.23＊＊ 120±5＊＊+Rut(L) 0.63 ±0.08* 42.75 ±8.08* 619.55 ±11.01＊＊ 123±15＊＊+CAPZ+Rut(H)0.51 ±0.09++35.59 ±7.10++908.13 ±22.87++ 219±11++

3 討論

吳茱萸次堿是蕓香科植物吳茱萸的干燥將近成熟果實(shí)中的一種吲哚喹唑啉類生物堿，具有廣泛的心血管效應(yīng)。最近有研究報(bào)道，吳茱萸次堿可抑制單核細(xì)胞遷移，提示具有抗AS效應(yīng)［10］。血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能障礙是AS血管病變的始動(dòng)因素，進(jìn)而循環(huán)中單核細(xì)胞與損傷內(nèi)皮黏附，遷移至內(nèi)膜并最終發(fā)展為泡沫細(xì)胞，是AS斑塊進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。保護(hù)血管內(nèi)皮，抑制單核細(xì)胞黏附是防治AS斑塊進(jìn)展的重要策略。高脂血癥、脂質(zhì)代謝失常是AS的重要病因，其中氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)在AS發(fā)生發(fā)展中起重要作用。LPC是Ox-LDL的主要活性成分，可誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)單核細(xì)胞黏附和泡沫細(xì)胞形成。因此，本實(shí)驗(yàn)采用LPC孵育內(nèi)皮細(xì)胞建立模擬AS內(nèi)皮損傷模型。我們前期在培養(yǎng)的HUVEC發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿可抑制LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和TNF-α的釋放［11］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，吳茱萸次堿對(duì)LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷具有明顯的保護(hù)效應(yīng)，表現(xiàn)為升高內(nèi)皮細(xì)胞活力，促進(jìn)內(nèi)皮保護(hù)因子NO生成，抑制ROS生成和單核細(xì)胞黏附。

近年來(lái)的大量研究提示，血管壁縫隙連接蛋白Cx的類型、數(shù)目和空間分布的改變所致的GJIC功能障礙參與AS發(fā)生發(fā)展［12］。目前對(duì)Cx和AS關(guān)系的研究主要集中在Cx37、Cx40和Cx43，前兩者可能有抗 AS效應(yīng)，而后者有促 AS作用［2］。在Apoe－/－小鼠模型，敲除Cx37基因可加速高膽固醇飲食誘發(fā)的AS斑塊形成［4］;選擇性敲除內(nèi)皮Cx40則升高黏附分子VCAM-1的表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞黏附，明顯增加AS斑塊面積［5］。本實(shí)驗(yàn)主要觀察吳茱萸次堿對(duì)有抗AS作用的內(nèi)皮Cx37、Cx40的mRNA和蛋白的表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):LPC損傷組與對(duì)照組相比，Cx37、Cx40的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)，GJIC功能也明顯抑制。這和整體水平的研究結(jié)果一致，Kwak等［13］在小鼠和人AS斑塊中發(fā)現(xiàn)，隨粥樣斑塊進(jìn)展，內(nèi)皮逐漸失去Cx37和Cx40的表達(dá)。這些結(jié)果提示，Cx37和Cx40表達(dá)下調(diào)所導(dǎo)致的GJIC功能障礙可能是AS血管病變的重要機(jī)制之一。目前的研究表明，Cx37和Cx40不僅可調(diào)節(jié)eNOS的表達(dá)和活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)NO的生成而保護(hù)血管內(nèi)皮［14］，還可通過(guò)抑制單核細(xì)胞與內(nèi)膜黏附而發(fā)揮抗AS作用。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同劑量的吳茱萸次堿(1.0、0.3、0.1 μmol·L－1)組與 LPC 損傷組相比，Cx37、Cx40的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，并明顯改善GJIC功能。這提示Rut的內(nèi)皮保護(hù)和抑制單核細(xì)胞黏附作用可能與上調(diào)Cx37和Cx40表達(dá)而改善GJIC功能有關(guān)。預(yù)先給予TRPV1阻斷劑CAPZ可取消Rut(H)組的內(nèi)皮保護(hù)作用及對(duì)Cx37、Cx40的水平、和GJIC功能的調(diào)節(jié)作用，表明Rut的內(nèi)皮保護(hù)作用及改善LPC誘導(dǎo)的GJIC障礙均與激活TRPV1有關(guān)。

TRPV1為一種配體門(mén)控的非選擇性陽(yáng)離子通道，可被辣椒素、高溫和氫離子等理化因素激活，導(dǎo)致2價(jià)陽(yáng)離子(主要是Ca2+)內(nèi)流。目前，關(guān)于TRPV1對(duì)GJIC的調(diào)控作用尚未見(jiàn)報(bào)道，我們推測(cè)可能與抗氧化途徑有關(guān)。氧化應(yīng)激是AS發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制，其中來(lái)源于NADPH氧化酶的ROS起主要作用。細(xì)胞內(nèi)ROS可通過(guò)氧化Cx或者改變其所在膜環(huán)境等誘發(fā)Cx構(gòu)象變化，從而抑制GJIC。在單核細(xì)胞和心肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿可抑制NADPH氧化酶活性，減少ROS生成，從而產(chǎn)生抑制單核細(xì)胞遷移和心肌保護(hù)作用［10］。有證據(jù)表明，TRPV1參與調(diào)節(jié)NADPH氧化酶活性和ROS的生成，其機(jī)制與調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+水平有關(guān)［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吳茱萸次堿可抑制LPC損傷內(nèi)皮中ROS的生成，而CAPZ阻斷TRPV1可取消這一效應(yīng)。我們推測(cè)，吳茱萸次堿激活TRPV1后，可能通過(guò)抑制NADPH氧化酶活性和ROS生成，進(jìn)而改善GJIC。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，吳茱萸次堿可減輕LPC誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和單核細(xì)胞黏附，恢復(fù)內(nèi)皮Cx37和Cx40的表達(dá)而改善GJIC，其機(jī)制與激活TRPV1有關(guān)。

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