何 萍，陳家歡，黃曉亮，于洪波，莫 寧

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院1.藥理學(xué)教研室2.中心實驗室，廣西南寧 530021)

阿片類依賴可造成明顯的自主神經(jīng)系統(tǒng)特別是交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的改變或損害，阿片類依賴的戒斷癥狀中交感神經(jīng)亢進癥狀亦為其重要表現(xiàn)之一［1］。交感神經(jīng)節(jié)是聯(lián)系交感神經(jīng)中樞和效應(yīng)器的神經(jīng)核團，阿片類依賴對交感神經(jīng)節(jié)的影響的研究很少。本研究組以往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性嗎啡處理后，交感神經(jīng)節(jié)——頸上神經(jīng)節(jié)(SCG)的快興奮性突觸傳遞［2］及突觸界面結(jié)構(gòu)［3］發(fā)生了適應(yīng)性改變;環(huán)腺苷酸(cAMP)水平也存在適應(yīng)性上調(diào)［4］。本研究在以劑量遞增法建立慢性嗎啡依賴及戒斷模型的基礎(chǔ)上，運用免疫組織化學(xué)方法和RT-PCR法分別檢測磷酸化的環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein，pCREB)和 CREB mRNA在SCG中的表達，進一步研究慢性嗎啡處理后交感神經(jīng)節(jié)適應(yīng)性改變的受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。

1 材料

1.1 動物 清潔級♂Wistar大鼠共40只，質(zhì)量190 g～210 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK桂2003-0003。

1.2 主要藥品與試劑 鹽酸嗎啡注射液，批號:080306，沈陽第一制藥廠生產(chǎn)。鹽酸納洛酮，Aldrich公司產(chǎn)品。兔抗pCREB多克隆抗體，工作濃度1∶200，北京市首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院多肽室制備;S-P免疫組織化學(xué)染色試劑盒(即用型)及DAB顯色劑:北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Trizol試劑，美國Invitrogen公司;cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，立陶宛MBI公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 儀器 日本OPATICAL公司OLYMPUS VANOX顯微鏡照相系統(tǒng);德國leica公司 DMR+550型病理圖像分析儀;美國Thermo公司高性能PCR擴增儀;美國Bio-Rad公司Gel Doc2000型凝膠電泳成像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 動物分組及處理 動物隨機分為4組(n=10):正常對照組、嗎啡急性給藥組、嗎啡依賴組和嗎啡戒斷組。各組處理如前文獻所述［4］，即嗎啡依賴組和嗎啡戒斷組大鼠連續(xù)皮下注射嗎啡5 d建立慢性嗎啡依賴大鼠模型，d 1～5每次劑量分別為10、20、30、40、50 mg·kg－1，每日 2 次;正常對照組和嗎啡急性給藥組大鼠皮下注射等體積生理鹽水共5 d。正常對照組、嗎啡急性給藥組和嗎啡依賴組大鼠分別在d 6晨注射生理鹽水、嗎啡20 mg·kg－1、嗎啡50 mg·kg－14 h后取材;嗎啡戒斷組大鼠在末次注射嗎啡50 mg·kg－14 h后，腹腔注射納洛酮4 mg·kg－1催促戒斷癥狀，并在注射納洛酮1 h后進行取材。取材時，腹腔注射戊巴比妥鈉60 mg·kg－1深度麻醉大鼠后，鏡下迅速摘取雙側(cè) SCG，備用。

2.2 pCREB蛋白免疫組織化學(xué)檢測 采用S-P法，按說明進行操作。顯微鏡下選入細胞均為細胞核呈棕褐色、與本底相比為中等到高度染色的陽性細胞。計算整個SCG內(nèi)的陽性免疫產(chǎn)物面積百分率反映蛋白表達水平。

陽性免疫產(chǎn)物面積百分率%=陽性免疫產(chǎn)物面積/SCG總測量面積×100%

2.3 CREB mRNA的RT-PCR法檢測 引物序列按文獻［5］，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下:GADPH sense primer 5’-TCA TTG ACC TCA ACT ACA TG-3’，antisense primer 5’-GCA GTG ATG GCA TGG ACT GT-3’(439 bp);CREB sense primer 5’-TCA GCC GGG TAC TAC CAT TC-3’，antisense primer 5’-TCT CTT GCT GCT TCC CTG TT-3’(252 bp)。PCR 循環(huán)參數(shù)為:94℃45 s，50℃ 45 s，72℃ 1 min，共 30 個循環(huán)。擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，檢測各擴增帶的光密度值，以GADPH校正作相對定量分析，結(jié)果以兩者的光密度比值表示。

3 結(jié)果

3.1 SCG中pCREB蛋白含量變化 pCREB免疫活性陽性產(chǎn)物主要在細胞核，胞質(zhì)相對淡染。以核陽性免疫產(chǎn)物面積百分率反映蛋白表達水平。結(jié)果顯示:與正常對照組相比，嗎啡急性給藥組大鼠SCG中pCREB蛋白含量明顯降低(P＜0.05);嗎啡依賴組大鼠SCG的pCREB蛋白含量回到正常對照組水平，并有增高趨勢(與正常對照組比較，P＞0.05;與嗎啡急性給藥組比較，P＜0.01);嗎啡戒斷組大鼠SCG中pCREB蛋白含量明顯高于正常對照組(P＜0.01)。結(jié)果見Tab 1和Fig 1。

Tab 1 Expression of pCREB and CREB mRNA in rat SCG(±s，n=10)

Tab 1 Expression of pCREB and CREB mRNA in rat SCG(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;△△P＜0.01 vs morphine acute group

Group pCREB positive area percentage/%CREB/GADPH mRNA ratio Control 1.58 ±0.41 0.65 ±0.18 Mor acute 0.91 ±0.25* 0.58 ±0.21 Mor dependent 1.92 ±0.55ΔΔ 0.72 ±0.26 Mor withdrawal 2.82 ±0.94＊＊ΔΔ0.61 ±0.19

3.2 SCG中 CREB mRNA表達變化 各組間CREB mRNA表達水平無差異(P＞0.05)。結(jié)果見Tab 1和 Fig 2。

Fig 1 Expression of pCREB in SCG(immunochemistry×400)

Fig 2 The expression of CREB mRNA in SCG

4 討論

反復(fù)應(yīng)用阿片類藥物，機體啟動適應(yīng)機制，神經(jīng)元及突觸功能發(fā)生適應(yīng)性改變，導(dǎo)致神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能發(fā)生長期改變，是機體形成藥物依賴和耐受的機制之一［6］。我們以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)［2－4］，嗎啡急性給藥能抑制交感神經(jīng)節(jié)SCG的快興奮性突觸傳遞并降低SCG中cAMP含量;嗎啡慢性處理后交感神經(jīng)節(jié)SCG的突觸傳遞、突觸界面結(jié)構(gòu)及cAMP含量均發(fā)生了適應(yīng)性改變，表現(xiàn)為嗎啡抑制快興奮性突觸傳遞的作用明顯減弱，突觸界面結(jié)構(gòu)中突觸后致密物厚度(PSD)增厚、突觸間隙變窄，cAMP含量較嗎啡急性給藥組明顯增加;納洛酮處理卻可增加SCG快興奮性突觸傳遞并進一步提高cAMP含量。因此推測cAMP的適應(yīng)性上調(diào)可能是嗎啡慢性處理后交感神經(jīng)節(jié)突觸適應(yīng)性改變的受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制之一。

CREB是一種核蛋白，是刺激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的主要成員，CREB的活化必須由磷酸化介導(dǎo)，多種通路已被證實可磷酸化CREB，其中研究最為透徹的為cAMP-cAMP依賴蛋白激酶A(PKA)通路對CREB的磷酸化。CREB分子N端的激酶誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(kinase inducible domain，KID)區(qū)包含有許多種蛋白激酶對CREB分子進行磷酸化的部位，其中第133位的絲氨酸殘基(Ser-133)是PKA的磷酸化位點。阿片類藥物與其受體結(jié)合后，通過升高胞漿內(nèi)cAMP水平激活PKA，使轉(zhuǎn)錄因子CREB的Ser133磷酸化而激活CREB，使其與DNA調(diào)控區(qū)的cAMP反應(yīng)元件(CRE)相結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)遲發(fā)而持久的基因表達，使短時程的生物學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L時程的生物學(xué)效應(yīng)，可造成神經(jīng)電活動的持久的改變，并導(dǎo)致神經(jīng)元胞體、突起或突觸結(jié)構(gòu)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變，參與慢性應(yīng)用嗎啡引起的神經(jīng)元和突觸的可塑性和適應(yīng)性改變［7］。阿片類藥物依賴的形成過程中，伴隨細胞內(nèi)cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的變化，藍斑區(qū)域也相應(yīng)發(fā)生CREB磷酸化［8］，而敲除CREB基因的小鼠嗎啡戒斷反應(yīng)的行為改變明顯減輕［9］，因此，推測cAMP-CREB通路的功能改變是形成和維持阿片依賴的重要機制。

在本研究中，嗎啡急性用藥，降低了大鼠SCG的pCREB蛋白含量;嗎啡慢性使用后，pCREB蛋白有所上調(diào)，并在納洛酮催促戒斷后進一步增高;但各組大鼠的CREB mRNA表達水平均無明顯改變。CREB磷酸化適應(yīng)性上調(diào)的改變與cAMP、快興奮性突觸傳遞及突觸界面結(jié)構(gòu)適應(yīng)性改變結(jié)果相一致，因此我們推測，通過cAMP和pCREB的適應(yīng)性上調(diào)，cAMP-CREB通路將可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)神經(jīng)元蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致慢性嗎啡處理后交感神經(jīng)節(jié)突觸傳遞及突觸界面結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性改變，從而參與嗎啡耐受、依賴和戒斷的發(fā)生和發(fā)展。

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