程 敏，王慶偉，劉雪英，鄧雅婷，賈 朝

(1.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥工程系，陜西商洛 726000;2.第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西西安 710032)

女貞子為木犀科女貞屬植物女貞(Ligustrum lucidumAit.又名大葉女貞)的成熟果實(shí)，其性味甘苦、涼，入肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)之功效，用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明［1］等癥。女貞子中所含的齊墩果酸含量較高，而熊果酸被證實(shí)有抗骨質(zhì)疏松的活性。女貞子醇提物能明顯提高去卵巢(OVX)大鼠骨無機(jī)質(zhì)、骨鈣含量，提高鈣平衡及鈣吸收率［2-4］。體外實(shí)驗(yàn)表明，蒸女貞子經(jīng)過水提醇沉所得的提取物可以明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化［5］。本研究采用去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型，研究女貞子治療骨質(zhì)疏松的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及配制 戊巴比妥鈉(Bioszune美國)，戊酸雌二醇(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司)，ALP、BALP酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)，OCN、DPD ELISA檢測(cè)試劑盒(Quidel美國)。女貞子藥材購自西安中藥飲片廠，經(jīng)陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室孫文基教授鑒定為Ligustrum lucidumAit.(Oleaceae)的果實(shí)。女貞子提取液制備過程如下:取1 000 g女貞子粉碎成粗粉，10倍量75%乙醇浸泡1 h，水浴80℃回流提取2 h，2次，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，最終將提取液濃縮至1 000 ml(每1 ml相當(dāng)于原藥材1 g)，4℃儲(chǔ)藏備用。采用反相高效液相色譜法［Kromasil-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:(甲醇-乙腈(50 ∶50):0.1%H3PO4=(85 ∶15)，檢測(cè)波長205 nm，柱溫25℃，流速1 ml·min-1］對(duì)女貞子粗提物中齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果兩者含量分別為0.83%、0.21%。戊酸雌二醇用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制成40 mg·L-1的混懸液，女貞子粗提液用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液配制成0.45 mg·L-1.以上藥液每次配制1周藥量，4℃保存，每天灌胃前恢復(fù)至室溫，搖勻。

1.2 主要儀器 7170A型全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI日本)、Lunar ProdigyAdvance DXA型骨密度儀(GE美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只♀未經(jīng)產(chǎn)3月齡SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(230±20)g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(軍)2007-007。飼養(yǎng)條件:開放式動(dòng)物飼養(yǎng)室，室溫控制在(23±2)℃，濕度(60±5)%，自然光源，標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng)(購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，含鈣0.9%，磷0.7%)，自由飲水。

1.4 骨質(zhì)疏松模型制備及分組給藥 將大鼠隨機(jī)分為2組，偽手術(shù)組10只、其余50只為去卵巢組。大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，偽手術(shù)組大鼠行假手術(shù)，其余大鼠行雙側(cè)卵巢去除術(shù)［6］。50只大鼠去卵巢手術(shù)4周后隨機(jī)分為5組。即，戊酸雌二醇組(EV，0.4 mg·kg-1·d-1)，女貞子大劑量組(FLL-H，9 g·kg-1·d-1)，女貞子中劑量組(FLLM，4.5·kg-1·d-1)，女貞子小劑量組(FLL-L，2.25 g·kg-1·d-1)和模型組(OVX)。手術(shù)1個(gè)月后，各組每天上午灌胃給藥1次，偽手術(shù)組(Sham)和OVX組也同時(shí)給予同體積0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，各組每周給藥6 d，共給藥26周，每周稱量體重1次。

各組大鼠連續(xù)給藥26周后收取尿液和血液。采用7170A型全自動(dòng)生化分析儀及相應(yīng)試劑盒測(cè)定血鈣(S-Ca)、血磷(S-P)、尿鈣(U-Ca)、尿磷(UP)和尿鉻(U-Cr)的含量;ELISA試劑盒測(cè)定血清堿性磷酸酶(ALP)、血清骨特異性堿性磷酸酶(BALP)含量、骨鈣素(OCN)含量、尿液中脫氧吡啶啉(DPD)含量;采用骨密度儀對(duì)大鼠全身骨骼進(jìn)行掃描，掃描時(shí)采用小動(dòng)物模式。掃描完畢后在GE公司配套的encore2006骨密度儀工作站上采用手動(dòng)圈出興趣區(qū)域自定義ROI(range of interests，ROI)的模式對(duì)各組大鼠的股骨、脛骨、第4椎骨的BMD(bone mineral density，BMD)進(jìn)行分析［7］。動(dòng)物處死后完整取下心、肝、脾、肺、腎、胸腺、腦、子宮進(jìn)行稱重，并用HE染色法進(jìn)行子宮病理切片。

Fig 1 Effects of 26-week treatment with EV，F(xiàn)LL-H，F(xiàn)LL-M，F(xiàn)LL-L on body weight，uterus and organ weight of ovariectomized(OVX)rats(±s)

2 結(jié)果

2.1 對(duì)去卵巢大鼠體重、子宮、臟器指數(shù)的影響如Fig 1 A所示，各組動(dòng)物手術(shù)前體質(zhì)量未見顯著性差異。從術(shù)后第10周開始，各去卵巢組大鼠與偽手術(shù)組大鼠相比體重增加(P＜0.05)。EV和FLL-M治療組均能對(duì)抗由于去卵巢導(dǎo)致的大鼠體重增加(P＜0.01)，F(xiàn)LL-H和FLL-L治療組從第10周開始也顯示出能明顯對(duì)抗去卵巢大鼠的體重增長，并且此作用一直延續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，但是與OVX組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)合各組大鼠子宮病理切片(Fig 2)和子宮系數(shù)Fig 1 B結(jié)果所示，連續(xù)給予雌激素26周后致使子宮肌細(xì)胞增生肥大、肌層增厚，促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)增生，子宮重量明顯增加。EV組大鼠子宮增生明顯，OVX組大鼠子宮明顯萎縮，各摘卵巢組大鼠子宮均小于Sham組，而FLL各劑量組大鼠子宮內(nèi)膜增生不明顯，接近OVX組，顯示了摘卵巢手術(shù)的成功。對(duì)各組大鼠子宮系數(shù)與Sham組相比，OVX組大鼠的子宮系數(shù)降低(P＜0.01)，EV組能明顯對(duì)抗這一現(xiàn)象，而FLL各劑量組對(duì)OVX組大鼠子宮系數(shù)均無影響。如Fig1 C中各組大鼠臟器指數(shù)所示，與Sham組相比，EV組、FLL各劑量組連續(xù)治療26周對(duì)去卵巢大鼠心、肝、脾、肺、腎、胸腺及腦的臟器指數(shù)沒有影響，解剖動(dòng)物的過程中各組臟器也未見異常。

Fig 2 Hematoxylin and eosin-stained sections of rat uteri obtained from(A)Sham control，(B)OVX control，(C)EV，(D)FLL-H，(E)FLL-M and(F)FLL-L.(×50)

2.2 對(duì)去卵巢大鼠血液及尿液中鈣、磷含量的影響血液及尿液中鈣、磷檢測(cè)結(jié)果(Tab 1)顯示:去卵巢26周后，與偽手術(shù)組相比，OVX組大鼠的S-Ca、S-P降低(P＜0.01)，U-Ca、U-P升高(P＜0.01);EV治療對(duì)S-Ca、S-P降低和U-Ca、U-P升高均有明顯的逆轉(zhuǎn)作用(P＜0.01);FLL-H和FLL-M組連續(xù)治療26周對(duì)OVX所致大鼠的 S-Ca、S-P、U-Ca、U-P變化均產(chǎn)生了影響(P＜0.05)，其中FLL-M組尤為明顯(P＜0.01);FLL-L組連續(xù)治療26周對(duì)OVX所致大鼠的U-Ca、U-P升高有明顯抑制作用(P＜0.05)，雖然能同時(shí)升高S-Ca和S-P水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab 1 Effects of 26-week treatment with EV，F(xiàn)LL-H，F(xiàn)LL-M，F(xiàn)LL-L on biochemical parameters in serum and urine of ovariectomized(OVX)rats

2.3 對(duì)去卵巢大鼠骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)(ALP、BALP、OCN、DPD)的 影 響 血 清 中 ALP［8］、BALP［9］、OCN［10］被廣泛認(rèn)為是評(píng)價(jià)骨形成的生化指標(biāo)，尿中DPD是反映骨吸收的生化指標(biāo)［11-12］。骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如Fig 3中所示:與偽手術(shù)組相比，OVX對(duì)大鼠血清中反應(yīng)骨轉(zhuǎn)化的所有指標(biāo) ALP、BALP、OCN和DPD均產(chǎn)生了影響(P＜0.01);EV連續(xù)治療26周對(duì)OVX所致大鼠血清ALP、BALP、OCN和DPD的升高具有明顯逆轉(zhuǎn)作用(P＜0.01);FLL各劑量組連續(xù)治療26周對(duì)OVX所致大鼠骨轉(zhuǎn)換的所有指標(biāo)具有明顯逆轉(zhuǎn)作用(P＜0.05)。

2.4 對(duì)去卵巢大鼠股骨、第4椎骨及脛骨骨密度的影響 骨密度儀檢測(cè)大鼠BMD結(jié)果如Fig 4顯示，去卵巢26周后，與偽手術(shù)組相比，OVX組大鼠的股骨、第4椎骨及脛骨的骨密度值均發(fā)生降低(P＜0.01);EV連續(xù)治療26周能抑制OVX誘導(dǎo)的大鼠股骨、第4椎骨及脛骨BMD的下降(P＜0.01);FLL-M組連續(xù)治療26周能升高大鼠股骨、第4椎骨及脛骨BMD(P＜0.01)，具有與雌激素相類似的功效，F(xiàn)LL-H、FLL-L能升高大鼠股骨BMD(P＜0.05)，而對(duì)大鼠第4椎骨及脛骨BMD無影響。

Fig 3 Effects of 26-week treatment with EV，F(xiàn)LL-H，F(xiàn)LL-M and FLL-L on bone turnover markers in ovariectomized(OVX)rats( ± s)

Fig 4 Effects of 26-week treatment with EV，F(xiàn)LL-H，F(xiàn)LL-M and FLL-L on the BMD in femur，4th lumbar vertebra and tibia of ovariectomized(OVX)rats by DXA(±s)

3 討論

大鼠去卵巢后雌激素分泌減少，子宮萎縮甚至功能消失，而雌激素缺乏是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的最主要因素之一［13］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠去卵巢26周后，體重明顯升高，子宮明顯萎縮，戊酸雌二醇治療組能明顯對(duì)抗這一現(xiàn)象，與先前報(bào)道的雌激素缺乏可以導(dǎo)致體重增加、子宮萎縮，而補(bǔ)充雌激素能明顯改善這一現(xiàn)象相一致［14-15］。女貞子中劑量組連續(xù)給藥26周能明顯降低去卵巢大鼠的體重增長，這可能與其能促進(jìn)雌激素分泌，從而促進(jìn)前體細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)阻止前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，并調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)能量代謝有關(guān)［16］。

堿性磷酸酶(ALP)和骨特異性堿性磷酸酶(BALP)都是參與骨代謝的重要蛋白質(zhì)，他們與血清中骨鈣素(OCN)都是反映成骨細(xì)胞活性的主要指標(biāo)。在骨吸收發(fā)生時(shí)，骨的Ⅰ型膠原會(huì)分解出脫氧吡啶啉(DPD)，釋放到血液中，并且以原形直接經(jīng)腎臟排出，是目前反映骨吸收最特異、最先進(jìn)的指標(biāo)之一［17-19］。因此，測(cè)定血尿中鈣磷物質(zhì)的含量及測(cè)定代表骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)的BALP、ALP、OCN和DPD含量對(duì)于了解骨代謝情況具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去卵巢26周后，各組大鼠血中鈣磷水平明顯下降，尿鈣尿磷排泄明顯增加，說明OVX大鼠處于負(fù)鈣平衡狀態(tài)，體內(nèi)鈣流失增加，吸收降低。本實(shí)驗(yàn)中觀察到，去卵巢組骨形成、骨吸收生化指標(biāo)(ALP、BALP、OCN、DPD)比對(duì)照組都明顯升高，說明OVX大鼠骨形成、骨吸收都異常增強(qiáng)，這一現(xiàn)象與臨床上絕經(jīng)后婦女呈現(xiàn)高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)相符合。戊酸雌二醇、女貞子中劑量有助于抑制去卵巢大鼠的高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，能增加鈣磷吸收率，降低骨丟失，使骨重建恢復(fù)平衡狀態(tài)，這與女貞子中劑量組連續(xù)治療26周能升高大鼠股骨、第4椎骨及脛骨的骨密度相一致?？傊?，女貞子對(duì)大鼠去卵巢所致的骨質(zhì)疏松癥有良好的治療效果，可以防止雌激素減少引起的體重增加，降低骨轉(zhuǎn)換率，增加大鼠股骨、第4椎骨、脛骨的骨密度，并且在治療OP的同時(shí)，長期用藥無明顯的毒副作用。

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