戴國梁，馬世堂，居文政，程小桂，謝麗艷，徐 潔，談恒山

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，江蘇南京 210029;3.南京軍區(qū)總醫(yī)院臨床藥理科，江蘇 南 京 210002)

阿司匹林又名乙酰水楊酸，在臨床使用已有100多年歷史。早期臨床上主要作為抗炎鎮(zhèn)痛藥物。近年來，隨著對其藥效的不斷深入研究，其抗血小板聚集活性逐漸成為其臨床主要應(yīng)用領(lǐng)域［1－2］，成為心血管疾病方面的一線藥物。

綠原酸(chlorogenic acid)是由咖啡酸與奎寧酸形成的縮酚酸，廣泛存在于植物中，以金銀花、杜仲中的含量較高，具有廣泛的藥理作用［3－5］。綠原酸作為一種自由基清除劑及抗氧化劑已被大量的試驗證明［6－7］。

中西藥合并使用是現(xiàn)代藥物治療的一大特點，若處方不當(dāng)，中西藥物相互作用，可能存在不良反應(yīng)，導(dǎo)致治療失敗。

臨床上，阿司匹林常與燈盞細(xì)辛注射液、脈絡(luò)寧注射液等中藥制劑合用，用于治療心腦血管疾病，并取得了良好的療效［8－9］。燈盞細(xì)辛注射液、脈絡(luò)寧注射液中含有一定量的綠原酸及其相似結(jié)構(gòu)的化合物。

通過參考相關(guān)文獻(xiàn)［10］，建立了阿司匹林酯酶體外代謝系統(tǒng)，通過考察該類化合物對阿司匹林酯酶活性的影響，為該類化合物與阿司匹林合用的安全性提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(配有G1311A四元泵、G1313A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314A 檢測器及 Chemstation(A.10.02)工作站);梅特勒－托利多AE240電子天平(上海梅特勒－托利多有限公司);Thermo冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司);Millipore Drict-Q5超純水機(jī)(法國Millipore公司);WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試藥 對照品阿司匹林(批號:100113－201104)和水楊酸(批號:100106－200303)購于中國食品藥品檢定研究院;非那西丁對照品(Sigma公司，批號:048K1586);綠原酸對照品(阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號:25908);新綠原酸、隱綠原酸對照品(成都曼斯特生物科技有限公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris，Wisent公司，批號:600127002)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取阿司匹林對照品6.00 mg 于 10 ml量瓶中，0.01 mol·L－1的 HCl溶解稀釋至刻度，得0.600 g·L－1的阿司匹林對照品儲備液。

精密稱取水楊酸對照品6.24 mg于10 ml量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，得0.624 g·L－1的水楊酸對照品儲備液。

精密稱取非那西丁對照品2.50 mg于10 ml量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，得0.250 g·L－1的非那西丁對照品儲備液。精密移取適量用甲醇稀釋成0.050 g·L－1非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液。

精密稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸適量，分別用甲醇定容至 10、1、0.5 g·L－1。

2.2 血漿阿司匹林酯酶的體外培養(yǎng) 精密吸取100 μl空白人血漿，加入10 μl阿司匹林溶液(120 g·L－1)，實驗組加入單體成分適量，對照組加入等量的溶媒(甲醇)后以Tris緩沖培養(yǎng)液(200 mol·L－1CaCl2，20 mol·L－1Tris-HCl，pH7.4)補(bǔ)足至 1 ml?；旌途鶆蚝蠓胖糜?7℃的水浴搖床中振蕩20 min，加入20 μl非那西丁內(nèi)標(biāo)(0.050 g·L－1)溶液，振蕩混勻后吸取0.5 ml于離心機(jī)試管中加入等體積0.5 ml乙腈，旋渦振蕩30 s(沉淀蛋白，中止反應(yīng))，以12 000 r·min－1離心10 min 后，吸取上清液50 μl。

2.3 血漿阿司匹林酯酶活性測定的色譜條件Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);檢測波長:235 nm;流速:1.0 ml·min－1;柱溫:35℃;流動相:甲醇－乙腈－0.2%H3PO4水溶液=20 ∶13 ∶67;進(jìn)樣量:20 μl。

2.4 血漿阿司匹林酯酶活性評價 以CSA/(CASA+CSA)值表示阿司匹林酯酶的活性，以(實驗組酶活性－對照組酶活性)/對照組酶活性評價阿司匹林酯酶活性變化。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性 在以上色譜條件下，阿司匹林、非那西丁(內(nèi)標(biāo))和水楊酸的保留時間分別為6.38，8.13，10.23 min，峰形良好，分離度 R≥1.5，且內(nèi)源性物質(zhì)及其他成分對測定無干擾，見Fig 1。

3.2 線性關(guān)系考察 取阿司匹林和水楊酸對照品儲備液適量，分別用0.01 mol·L－1的HCl和甲醇稀釋至不同濃度，分別精密移取10 μl阿司匹林和水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于0.98 ml培養(yǎng)體系中(含0.88 ml Tris溶液和0.1 ml血漿)，使阿司匹林和水楊酸在培養(yǎng)體系中總體積為1 ml，其終濃度分別為6、4、2、1、0.8、0.3、0.06 mg·L－1和 6.24、3.12、1.56、0.78、0.39、0.13、0.078 mg·L－1。從“加入 20 μl非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液”起，按2.2項下方法處理樣品，進(jìn)行HPLC分析。以阿司匹林與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)，以阿司匹林在培養(yǎng)體系中的最終濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程=0.510 9X－0.019 5(r=0.999 7)，最低定量限為0.06 mg·L－1。以水楊酸與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)，以水楊酸在培養(yǎng)體系中的最終濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程=1.138 7X+0.071 8(r=0.999 6)，最低定量限為 0.078 mg·L－1。

3.3 精密度試驗 取阿司匹林和水楊酸對照品儲備液適量，用相應(yīng)溶劑分別稀釋成低、中、高3種不同濃度的質(zhì)控樣品，分別精密移取10 μl阿司匹林和水楊酸質(zhì)控樣品于0.98 ml培養(yǎng)體系中(含0.88 ml Tris溶液和0.1 ml血漿)，使最終的總體積為1 ml，使阿司匹林在培養(yǎng)體系中最終質(zhì)量濃度分別為0.15、1、4 mg·L－1，水楊酸在培養(yǎng)體系中最終質(zhì)量濃度分別為0.13、0.78、3.12 mg·L－1。從上述“加入20 μl非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液”起按2.2項下方法處理樣品，進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得藥物濃度，日內(nèi)測定5次，日間測定5天。阿司匹林和水楊酸的日內(nèi)和日間精密度見Tab 1。

Tab 1Precision of aspirin and salicylic acid(±s，n=5)

Tab 1Precision of aspirin and salicylic acid(±s，n=5)

Reference substance Spiked C/mg·L－1 Intra-day precision Measured C/mg·L－1RSD/%Inter-day precision Measured C/mg·L－1RSD/%ASA 0.15 0.16 ±0.006 3.86 0.16 ±0.012 7.50 1 0.98 ±0.044 4.61 0.97 ±0.046 4.74 4 4.01 ±0.382 9.54 3.98 ±0.211 5.30 0.13 0.14 ±0.007 5.00 0.13 ±0.006 4.62 SA 0.78 0.79 ±0.041 5.11 0.79 ±0.053 6.71 3.12 3.47 ±0.241 6.95 3.23 ±0.221 6.84

Fig 1 HPLC chromatograms of the aspirin esterase activity

3.4 回收率試驗 分別在加入100 μl空白血漿和不加空白血漿的培養(yǎng)液中按培養(yǎng)體系最終質(zhì)量濃度0.13、0.78、3.12 mg·L－1加入 10 μl水楊酸，按0.15、1、4 mg·L－1加入 10 μl阿司匹林，并最終用Tris液補(bǔ)足至1 ml，混勻后，從“加入20 μl非那西丁內(nèi)標(biāo)溶液”起，按“2.2”項下方法處理樣品，進(jìn)行HPLC分析，將兩組峰面積相比，計算相應(yīng)的提取回收率，每個濃度分別測定5次，結(jié)果見 Tab 2。由Tab 2可見阿司匹林和水楊酸的提取回收率符合要求。

Tab 2 Extraction recovery of aspirin and salicylic acid( ± s，n=5)

Tab 2 Extraction recovery of aspirin and salicylic acid( ± s，n=5)

Reference substance Spiked C/mg·L－1 Extraction recovery/%RSD/%ASA 0.15 95.5 ±2.2 3.45 1 96.5 ±1.7 4.34 4 96.2 ±3.2 4.24 SA 0.13 92.3 ±4.3 5.34 0.78 97.6 ±3.3 4.28 3.12 98.7 ±3.2 4.82

3.5 綠原酸及其同分異構(gòu)體對阿司匹林酯酶活性的影響 實驗組設(shè)立各單體成分低、中、高3個濃度(終濃度為 5、10、100 mg·L－1)，對照組加入等量的溶媒(甲醇)，按“2.2”項下條件進(jìn)行體外培養(yǎng)，每個單體成分每個濃度平行做5份，結(jié)果見Tab 3。

Tab 3 Changes of aspirin esterase activity in the presence or absence of chlorogenic acid and its isomers(±s，n=5)

Tab 3 Changes of aspirin esterase activity in the presence or absence of chlorogenic acid and its isomers(±s，n=5)

#changes of enzyme activity=(enzyme activity of experimental group-enzyme activity of control group)/enzyme activity of control group

Compound Name Final concentration/mg·L－1 Enzyme activity CSA/(CASA+CSA )Control Experimental Changes of enzyme activity#/%P Chlorogenic 100 0.276 ±0.002 0.272 ±0.002 －1.45 0.111 acid 10 0.276 ±0.002 0.277 ±0.004 +0.36 0.997 5 0.276 ±0.002 0.285 ±0.002 +3.26 0.135 Cryptochlorogenic 100 0.309 ±0.005 0.309 ±0.003 0 0.629 acid 10 0.309 ±0.005 0.325 ±0.003 +5.18 0.144 5 0.309 ±0.005 0.332 ±0.004 +7.44 0.196 Neochlorogenic 100 0.309 ±0.005 0.325 ±0.001 +5.18 0.133 acid 10 0.309 ±0.005 0.326 ±0.005 +5.50 0.236 5 0.309 ±0.005 0.334 ±0.004 +8.09 0.107

4 討論

4.1 阿司匹林酯酶體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化 因人全血更接近人體內(nèi)環(huán)境，本研究剛開始以人的全血作為阿司匹林酯酶的來源，且全血中酯酶的活性高于血漿中酯酶活性，但新鮮全血獲取難度大且難以保存，同時難以保證整個實驗中使用的全血來源基本相同且差異性較小。故最終選擇易獲取、易保存、較穩(wěn)定的人混合血漿代替全血作為酯酶來源。

本研究在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了阿司匹林酯酶的體外培養(yǎng)體系，降低了血漿及Tris液的體積，使整個培養(yǎng)體系的體積為1 ml。培養(yǎng)體系體積減少，一方面可節(jié)約人血漿和Tris液的使用量;另一方面體積減小可適當(dāng)提高酯酶水解阿司匹林產(chǎn)生的水楊酸濃度，這樣可降低對儀器靈敏度的要求，并且可提高分析的準(zhǔn)確度。

將10 μl濃度為120 g·L－1的阿司匹林加入含有100 μl血漿的總體積為1 ml Tris培養(yǎng)液中(A組)，發(fā)現(xiàn)A組中阿司匹林含量減少30%;同時將10 μl濃度為 120 g·L－1的阿司匹林加入不含有100 μl血漿的總體積為1 ml Tris培養(yǎng)液中(B組)，發(fā)現(xiàn)B組中阿司匹林含量減少3%，B組中阿司匹林的自然水解對實驗結(jié)果的影響可以忽略不計，說明該培養(yǎng)體系切實可行。

4.2 綠原酸及其同分異構(gòu)體對酯酶活性的影響

在本實驗濃度下，發(fā)現(xiàn)綠原酸及其同分異構(gòu)體對酯酶活性均沒有明顯影響，甚至還出現(xiàn)微弱的誘導(dǎo)作用。同時，本實驗還可以看出，以上化合物對阿司匹林酯酶的作用存在劑量依賴性，即隨著化合物濃度降低，該化合物對酯酶的抑制作用逐步減弱或誘導(dǎo)作用逐步增強(qiáng)。

從阿司匹林酯酶代謝途徑來看，綠原酸及其同分異構(gòu)體不影響阿司匹林的代謝，可以推測綠原酸及其同分異構(gòu)體成分與阿司匹林發(fā)生代謝性相互作用的可能性較小，為臨床合理用藥提供一定的理論依據(jù)。

4.3 關(guān)于本研究的進(jìn)一步探索 綠原酸與隱綠原酸、新綠原酸結(jié)構(gòu)相似，互為同分異構(gòu)體，但從Tab 3可以看出3個化合物對酯酶活性的影響還是有一定差異的，這說明化合物結(jié)構(gòu)的微小改變可能影響到阿司匹林酯酶的活性。接下來，本研究將深入探索其他咖啡酰奎寧酸類成分對酯酶活性的影響，并運(yùn)用其他實驗方法進(jìn)一步評價該類化合物與阿司匹林臨床合用的安全性。

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