陳方軍，李 俊

(1.安慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)系，安徽安慶 246052;2.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032)

肝內(nèi)免疫反應(yīng)是病毒性肝損傷的重要機(jī)制之一，刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)可引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、氧自由基表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，肝細(xì)胞變性、壞死，引起急性免疫性肝損傷［1］。依達(dá)拉奉是目前在臨床試驗(yàn)中證明效果優(yōu)越的自由基清除劑［2］，在對(duì)多種臟器損傷保護(hù)作用的研究中均提示自由基清除和抑制脂質(zhì)過氧化的作用是其重要作用機(jī)制。因此，本課題擬采用Con A致小鼠急性免疫性肝損傷模型，探討依達(dá)拉奉對(duì)急性實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用和部分機(jī)制，以期為進(jìn)一步拓寬依達(dá)拉奉的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑 ConA購自 Sigma公司，規(guī)格為100mg;依達(dá)拉奉注射液由吉林博大制藥公司提供;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;DEPC H2O、TRIzol試劑購自Invitrogen公司;RT－PCR試劑盒購于Promega公司，特異性引物由上海生物工程技術(shù)和服務(wù)公司合成;CYP 2E1抗體購于Upstate公司。

1.2 主要儀器 美國(guó)Biometra公司垂直電泳系統(tǒng)和梯度PCR儀;DU2600紫外分光光度計(jì)，BECKMAN公司;高速冷凍離心機(jī)，BECKMAN公司。

1.3 動(dòng)物處理 BALB/c小鼠60只，♂，體質(zhì)量18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食，維持12 h光照和12h黑暗的晝夜節(jié)律，溫度20℃ ～25℃，相對(duì)濕度(50±5)%。將健康小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只:正常對(duì)照組、Con A肝損傷組、依達(dá)拉奉(4、8、16 mg·kg－1)處理組、還原性谷胱甘肽(50 mg·kg－1)處理組。所有小鼠在給藥前均禁食1 h，給藥組于給予Con A前24 h、8 h和1 h分別腹腔注射相應(yīng)劑量依達(dá)拉奉和還原性谷胱甘肽。正常組小鼠尾靜脈注射PBS溶液0.3 ml，其他各組按 Con A 20 mg·kg－1以PBS溶液稀釋為0.3 ml尾靜脈注射造模，在末次給藥后禁食6 h取材，眼眶靜脈叢采血，血清用來測(cè)生化指標(biāo);頸椎脫臼處死小鼠，取相同部位肝臟用于總RNA的提取、蛋白質(zhì)免疫印跡分析和組織病理學(xué)檢查。

1.4 血清肝生化指標(biāo)檢測(cè) 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒規(guī)范操作。

1.5 肝組織病理檢查 肝組織置于4%多聚甲醛中固定。經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片、HE染色、中性樹脂封片后，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理改變。

1.6 肝勻漿SOD活力、GSH水平、MDA含量檢測(cè)用冷生理鹽水制備10%肝勻漿，檢測(cè)肝組織中SOD活力及GSH、MDA含量。GSH水平用Griffith法檢測(cè)。通過測(cè)定脂質(zhì)過氧化的羰基產(chǎn)物MDA含量反映組織的氧化應(yīng)激水平，MDA含量測(cè)定采用TBARS 比色法［3］。

1.7 總RNA的分離和逆轉(zhuǎn)錄 50 mg小鼠肝臟組織用TRIzol試劑盒提取總RNA。DNA酶消化基因組DNA。通過測(cè)定260 nm波長(zhǎng)下樣品的吸光度值確定樣品中RNA含量，用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)RNA的完整性。每份樣品中取1 μg總RNA用于合成cDNA。20 μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含25 mmol·L－1Tris · HCl(pH 8.3)、37.5 mmol·L－1KCl、10 mmol·L－1DTT、1.5 mmol·L－1MgCl2、10 mmol·L－1dNTP、0.5 mg oligo(dT)15引物及 20 U 逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)體系在42℃孵育60 min后，在95℃中止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.8 PCR擴(kuò)增 50 μl PCR反應(yīng)體系中含2.5 μl cDNA、1 × PCR 緩沖液、1.5 mmol·L－1MgCl2、200 μmol·L－1dNTP混合物、1 U耐熱性DNA聚合酶、1 μmol·L－1正向引物和逆向引物。使用GAPDH做內(nèi)對(duì)照。CYP2E1基因引物序列:正向，5'-AGT GTT CAC ACT GCA CCT GG-3';逆向，5'-CCT GGA ACA CAG GAA TGT CC-3'，片段長(zhǎng)度為125 bp。GAPDH基因引物序列為:正向，5'-GAG GGG CCA TCC ACA GTC TTC-3';逆向，5'-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG-3'，片段長(zhǎng)度為340 bp。CYP2E1擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min，1個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃ 延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)。GAPDH PCR擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性3 min，1個(gè)循環(huán);94℃變性30 s，56℃退火30s，72℃ 延伸 1 min，30 個(gè)循環(huán)。末次循環(huán)后 72℃孵育 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg·L－1溴化乙錠)電泳45 min后鑒定分析。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡 稱取0.1 g肝臟組織樣品，加入1 ml RIPA 裂解液(pH 7.4，50 mmol·L－1Tris-HCl、150 mmol·L－1NaCl、1% 脫氧膽酸鈉、1%Triton X-100、0.1%SDS、1 mmol·L－1EDTA 和 1 mmol·L－1PMSF)置于冰上勻漿裂解 30 min，再以15 000×g離心15 min，取上清液后蛋白定量至10 g·L－1，接著加入2×上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min使蛋白變性，－20℃貯存。50 μg蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠垂直電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，膜于5%脫脂牛奶中4℃封閉過夜后室溫孵育一抗CYP2E1(1 ∶2 500)、或 β-actin(1 ∶2 000)2 h，以DPBS-T洗膜40 min，接著將膜于室溫孵育二抗(山羊抗兔IgG)2 h，以DPBS-T洗膜40 min后再以DPBS浸洗10 min。最后用化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯跡，X線壓片曝光成像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 CYP2E1 mRNA水平以內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)照組的光密度標(biāo)定為 1。CYP2E1蛋白水平以內(nèi)參β-actin標(biāo)準(zhǔn)化，對(duì)照組的光密度值標(biāo)定為1。所有計(jì)量資料試驗(yàn)結(jié)果用±s的方式表示，方差分析和SNK方法檢驗(yàn)各組之間差異。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)免疫性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)的影響 見Tab 1，與正常組相比，ConA模型組大鼠血清 ALT、AST 明顯升高，依達(dá)拉奉(4、8、16 mg·kg－1)、還原性谷胱甘肽處理組血清ALT、AST水平均較正常組升高，比模型組有明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。(Tab 1)

Tab 1 Effects of edaravone on serum ALT and AST concentration in mice with ConA-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

Tab 1 Effects of edaravone on serum ALT and AST concentration in mice with ConA-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;△△P＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg－1 ALT/U·L－1 AST/U·L －1 Normal 0 29.6 ±1.8 59.3 ±3.9 Model 0 41.6 ±2.6△△ 91.5 ±4.8△△Edaravone 4 37.5 ±2.9* 78.6 ±4.7*8 36.2 ±2.7* 72.8 ±4.2*16 31.6 ±2.6＊＊ 65.5 ±5.2＊＊GSH 50 32.7 ±3.9* 66.8 ±5.7＊＊

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)免疫性肝損傷小鼠引起肝臟組織脂質(zhì)過氧化和GSH消耗、SOD活力的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝勻漿中MDA的含量明顯上升，而SOD活性、GSH的含量明顯降低。與模型組比較，依達(dá)拉奉(8、16 mg·kg－1)能明顯降低用藥組小鼠肝勻漿中MDA的含量，明顯升高SOD活性和GSH含量(P＜0.01，Tab 2)。

Tab 2 Effects of edaravone on MDA，SOD and GSH in liver homogenate in mice with Con A-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

Tab 2 Effects of edaravone on MDA，SOD and GSH in liver homogenate in mice with Con A-induced immune hepatic injury(±s，n=10)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model;△△P＜0.01 vs normal

Group Dose/mg·kg－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro GSH/mg·g－1Pro Normal 0 3.01 ±0.35 23.01 ±0.57 5.21±0.27 Model 0 7.23±1.11△△ 15.11±1.66△△ 2.96±0.36△△Edaravone 4 6.01 ±0.81＊＊ 16.45 ±2.02* 3.32±0.23*8 4.95±0.35＊＊ 18.24±0.88＊＊ 3.77 ±0.25＊＊16 3.74±0.71＊＊ 19.41±1.09＊＊ 4.32±0.63＊＊GSH 50 3.62±0.34＊＊ 20.85±0.63＊＊ 4.45±0.42＊＊

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)小鼠肝臟病理組織學(xué)變化的影響

如Fig 1所示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，未見變性與壞死。模型組輕度空泡變性，肝小葉界限模糊，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分位置細(xì)胞核溶解、壞死。還原性谷胱甘肽處理組病變較輕，但仍有少量標(biāo)本炎細(xì)胞浸潤(rùn)和散在點(diǎn)狀壞死;依達(dá)拉奉小劑量組各標(biāo)本均有散在點(diǎn)狀壞死、輕度脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);依達(dá)拉奉中劑量組未見散在點(diǎn)狀壞死，各標(biāo)本仍見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和輕度脂肪變性;依達(dá)拉奉大劑量組肝細(xì)胞排列較整齊，肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少。

Fig 1 Effects of edaravone on liver histopathology in mice with ConA-induced immune hepatic injury(HE stained，×200)

2.4 依達(dá)拉奉對(duì)免疫性肝損傷小鼠肝臟組織CYP 2E1 mRNA水平的影響 結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠肝組織CYP 2E1 mRNA明顯上升(P＜0.01);與模型組相比，依達(dá)拉奉(8、16 mg·kg－1)處理組降低了肝臟組織CYP 2E1 mRNA表達(dá)(P＜0.01，F(xiàn)ig 2)。

2.5 依達(dá)拉奉對(duì)肝臟組織CYP 2E1蛋白表達(dá)水平的影響 結(jié)果顯示，與模型組相比，依達(dá)拉奉組(8、16 mg·kg－1)明顯的抑制了肝臟組織CYP 2E1蛋白表達(dá)水平。

Fig 2 mRNA expression of CYP2E1 in the mouse liver tissue of each group

Fig 3 Expression of CYP2E1 protein level in mouse liver tissues of each group

3 討論

ConA誘發(fā)的小鼠免疫性肝損傷是常用的肝損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。ConA是對(duì)肝細(xì)胞具有特異性毒性作用的植物凝集素，其基本病理特點(diǎn)是在體外可激活T細(xì)胞的絲裂原而致免疫性肝損傷，與人類慢性肝炎病變非常接近，且有肝臟特異性和靶向性，因此非常適合研究人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的病理機(jī)制和進(jìn)行抗肝損傷的藥物篩選［4］。本實(shí)驗(yàn)血清學(xué)顯示ConA模型組肝細(xì)胞損傷，轉(zhuǎn)氨酶升高;病理學(xué)提示，肝細(xì)胞水腫、氣球樣變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，符合病毒性肝炎、自身免疫性肝病等的表現(xiàn)。

依達(dá)拉奉對(duì)自由基毒性損傷具有強(qiáng)大的抑制作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病腦出血、腦梗死等疾病具有確切療效，能夠減輕自由基導(dǎo)致的級(jí)聯(lián)損傷，由于其獨(dú)特的清除自由基作用，其適應(yīng)證臨床應(yīng)用更加廣泛［5］。本文在BALB/c小鼠預(yù)防性給予依達(dá)拉奉后，與模型組比較，依達(dá)拉奉能明顯降低ConA小鼠血清ALT、AST水平，病理組織學(xué)檢查顯示小鼠肝臟的炎癥程度明顯減輕。提示依達(dá)拉奉對(duì)免疫性肝損傷小鼠具有明顯的治療作用。

SOD是保護(hù)肝臟細(xì)胞器免受自由基攻擊的重要的抗氧化物質(zhì)，MDA是脂質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，GSH水平反映機(jī)體抗氧化能力，其下降表明機(jī)體抗氧化能力下降，生成自由基增加［6－7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示依達(dá)拉奉可以明顯升高免疫性肝損傷小鼠肝臟SOD水平，減少M(fèi)DA的生成，升高了降低的GSH水平，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，改善由過氧化反應(yīng)引起的肝損傷。提示依達(dá)拉奉防治小鼠免疫性肝損傷的機(jī)制可能與其提高機(jī)體抗氧化能力、保護(hù)肝細(xì)胞器免受自由基的攻擊有關(guān)。

CYP450酶系是機(jī)體中催化外來物進(jìn)行代謝的主要酶系，可通過氧化或環(huán)氧化反應(yīng)產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物。CYP2E1是肝臟I相代謝酶細(xì)胞色素P450家族的主要亞型之一，眾多的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后可經(jīng)CYP2E1代謝活化而具有細(xì)胞毒性，許多毒物(包括致癌物)也可經(jīng) CYP2EI激活;同時(shí)，CYP2E1也是細(xì)胞色素P450中產(chǎn)ROS活性最強(qiáng)的亞型，CYP 2El可以引起許多毒性物質(zhì)的代謝和激活，催化產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，如超氧陰離子基團(tuán)和過氧化氫等，與氧化應(yīng)激關(guān)系密切［8］。研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉處理組明顯降低了肝臟組織CYP 2E1 mRNA表達(dá)以及CYP 2E1蛋白水平，提示抑制肝臟CYP2E1過度表達(dá)是依達(dá)拉奉治療免疫性肝損傷的機(jī)制之一，通過調(diào)節(jié)CYP450的功能來調(diào)節(jié)免疫性肝損傷的氧化代謝，減少氧自由基的生成，減弱氧化應(yīng)激損傷，從而起到一定的肝臟保護(hù)作用。

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