孫雪芳，王洪新，梁靈君，魯美麗，顧潔瑩，何海洋

(遼寧醫(yī)學院心腦血管藥物重點實驗室，遼寧錦州 121001)

黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是中藥黃芪的主要活性成分之一，可以提高心肌細胞存活率，抑制細胞凋亡，對缺氧/復氧損傷心肌細胞有保護作用［1］。脂多糖(lipopolysaccharide ，LPS)，是革蘭陰性菌的主要致病成分，可誘導病理性心肌肥厚，表現(xiàn)為心肌細胞體積增大，肌動蛋白絲重組等［2］。LPS誘導的炎癥反應主要由 TLR4受體介導，當TLR4被激活時，與分子伴侶熱休克蛋白60結合，激活核因子-κB(nuclear factor-κB ，NF-κB)，誘導單核/巨噬細胞產(chǎn)生免疫炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-6(IL-6)等，引起心肌細胞肥大，心肌收縮力異常及心肌細胞的凋亡［3］。有研究顯示，APS對LPS誘導的大鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-1有不同程度的抑制作用，提示其可通過抑制炎癥因子的分泌，減少組織細胞的損傷發(fā)揮其對機體的保護作用［4］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在抑制LPS誘導心肌細胞肥大的同時，可降低TNF-α的表達量［5］，但是否是通過 TLR4-NF-κB 通路降低 TNF-α的量，從而對LPS誘導的心肌肥大產(chǎn)生保護作用，尚未進行深入探討。因此本實驗用LPS誘導SD乳鼠心肌細胞肥大，旨在從TLR4/NF-κB信號途徑入手觀察APS對LPS誘導心肌肥大的保護作用及具體機制。

1 材料

1.1 動物 出生2～3 d的SD大鼠乳鼠，♀♂不拘，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007。

1.2 藥品與試劑 黃芪多糖，陜西森弗生物技術有限公司，批號:HQ090312，純度98%;LPS，Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;IκBα抑制劑BAY11-7082江蘇碧云天生物工程公司;TNF-α ELISA檢測試劑盒，研域(上海)化學試劑有限公司;IκBα一抗，北京博奧森生物技術有限公司;RT-PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.3 儀器設備 超凈工作臺，江蘇吳縣市凈化技術研究所;CO2孵箱，美國Sheldon Manufacturing Inc公司;79-1磁力加熱攪拌器，江蘇金壇中大儀器廠;TDL-4型離心機，上海安亭科學儀器廠;DNM-9602G酶標分析儀，北京普朗新技術有限公司;倒置相差顯微鏡，德國Leica公司。

2 方法

2.1 乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 乳鼠無菌條件下開胸取出心臟，D-Hanks液清洗血液，修剪除去相連血管及組織，保留心尖部分，眼科剪將其剪成0.5～1 mm3大小的組織塊，用0.08%的胰酶37℃恒溫消化10 min，吸取上清液棄去，再加入0.08%胰酶37℃恒溫消化4～5次，每次約8 min，收集消化所得細胞，過篩網(wǎng)得到的單個細胞置于含15%小牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中，裝入培養(yǎng)瓶在5%CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)1.5～2 h，差速貼壁法得到心肌細胞，接種于培養(yǎng)瓶于孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 分組及給藥 常規(guī)培養(yǎng)心肌細胞48 h后，將心肌細胞分為7組，分別為:①對照組，不作任何處理;②模型組，用LPS 1 mg·L－1作用于乳鼠心肌細胞;③ LPS+BAY11-7082 組，用 5 μmol· L－1的BAY11-7082孵育心肌細胞30 min后加入1 mg·L－1LPS;④LPS+APS 25 mg·L－1組，用黃芪多糖25 mg·L－1孵育乳鼠心肌細胞30 min后，再加入1 mg·L－1的 LPS;⑤LPS+APS 50 mg·L－1組，用黃芪多糖50 mg·L－1孵育乳鼠心肌細胞30 min后，再加入1 mg·L－1的 LPS;⑥LPS+APS 100 mg·L－1組，用黃芪多糖100 mg·L－1孵育乳鼠心肌細胞30 min后，再加入 1 mg·L－1的 LPS;⑦BAY11-7082單用組，BAY11-7082孵育心肌細胞30 min后不作任何處理繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 心肌細胞體積測定 將心肌細胞經(jīng)“2.2”項方法分組和處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出，棄去各孔培養(yǎng)液，PBS快速沖洗3～4次后加0.1%胰酶在培養(yǎng)箱中孵育10 min后取出，隨即馬上加入含0.1%血清的DMEM終止消化。將合并收集的細胞注入一細胞室內(nèi)(該細胞室底部是一經(jīng)硅化的蓋玻片，防止心肌細胞貼壁)，在×400倒置顯微鏡下觀察細胞，幾乎均呈球形。用計算機CIAS大恒細胞圖像分析系統(tǒng)測量單個細胞的直徑，進而計算出細胞的體積。每孔隨機選擇4個視野，每個視野測20個細胞。

2.4 心肌細胞蛋白含量測定 將心肌細胞經(jīng)“2.2”項方法分組和處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出，棄去各孔培養(yǎng)液，D-hanks液沖洗3～4次后加入細胞裂解液SDS使細胞裂解，采用Bradford法測定每組細胞的總蛋白含量。

2.5 心肌細胞TLR4 mRNA表達測定 將心肌細胞接種于培養(yǎng)瓶中，經(jīng)“2.2”項方法分組處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，收集各組細胞，加入TRIzol試劑完全裂解細胞，將細胞裂解液收集起來以氯仿進行抽提，用異丙醇沉淀，回收總RNA于－80℃貯存?zhèn)溆谩?%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(A260/A280)鑒定RNA濃度和純度。取約1 μg進行反轉錄。反轉錄條件為:42℃、60 min，99℃、2 min，4℃保存。TLR4的引物序列(5'-3')為:up:CTATCATCAGTGTATCGGTG，down:CAGTCCTCATTCTGGCTC(186bp);內(nèi)參GAPDH的引物序列(5'-3')為:up:AATGCATCCTGCCACCACCAACTGC，down:GGAGGCCATGTAGGCCATGAGGTC(550 bp)。PCR反應條件為:94℃ 45 s，55℃ 50 s，72℃ 1 min 15 s。循環(huán)擴增結束后，取10μl反應產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，接收后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和分析。

2.6 心肌細胞TNF-α測定 將心肌細胞按“2.2”項方法和處理后，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細胞上清液，在無菌操作條件下按照ELISA試劑盒說明書測定細胞上清液中TNF-α的量，此項指標可反映出心肌細胞TNF-α的蛋白表達水平。

2.7 心肌細胞IκBα蛋白測定 將經(jīng)“2.2”項方法分組和處理的心肌細胞在培養(yǎng)48 h后取出，收集各組細胞，提取各組心肌細胞總蛋白，采用考馬斯亮藍法定量。灌膠上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察Marker移動情況，根據(jù)所需適時終止電泳。取出電泳凝膠進行轉膜，然后將得到的PVDF膜浸入封閉液置于搖床上緩慢搖1 h以上。用洗膜液略洗一下PVDF膜，切割后分別置于已按說明書稀釋過的IκBα一抗溶液中，4℃雜交過夜。d 2取出用TBST沖洗3次，然后將PVDF膜放入二抗中搖床雜交1 h，取出洗膜，進行ELC反應上機檢測。

2.8 數(shù)據(jù)處理 統(tǒng)計數(shù)據(jù)以SPSS 13.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因數(shù)方差分析及LSD法。

3 結果

3.1 APS對心肌細胞體積和蛋白含量的影響 從Tab 1可以看出，LPS模型組同正常對照組比較，心肌細胞體積增大了46.7%，蛋白含量增加了66.0%;同 LPS模型組相比較，LPS+BAY11-7082組的心肌細胞體積減小了33%，蛋白含量降低了28.3%;APS低中高劑量組同LPS模型組相比，心肌細胞體積分別減小了15%、25.6%、34.3%，蛋白含量分別降低了13.4%、23.7%、29.7%，表明APS和BAY11-7082均對心肌細胞肥大有明顯的抑制作用，且APS存在劑量依賴性;而BAY11-7082單用組同正常對照組相比心肌細胞體積和蛋白含量并無明顯變化，表明IκBα阻斷劑對正常心肌細胞的體積和蛋白含量并無明顯影響。

Tab 1 Effects of different treatment on protein content and cell size of cultured ventricular myocytes of neonatal rats

3.2 APS對心肌細胞TLR4 mRNA表達的影響Fig 1和Tab 2的結果顯示，同空白對照組比較，LPS模型組TLR4 mRNA表達增加了61.2%;與模型組比較，LPS+BAY11-7082組和APS中高劑量組中TLR4 mRNA表達明顯降低(P＜0.01)，表明APS可能是通過抑制TLR4 mRNA的表達從而對LPS誘導的心肌細胞肥大起到保護作用。

Fig 1 Expression of TLR4 mRNA in cardiac myocytes of cultured neonatal rats

Tab 2 Effects of different treatment on TLR4 mRNA expression in cultured myocardial cells of neonatal rats(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different treatment on TLR4 mRNA expression in cultured myocardial cells of neonatal rats(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS

Group TLR4 mRNA(IA TLR4∶IA GAPDH)Normal 0.231 ±0.002 LPS(1 mg·L－1) 0.698 ±0.019＊＊LPS+BAY11(5 μmol·L －1) 0.355 ±0.031##LPS+APS 25 mg·L －1 0.579 ±0.025#LPS+APS 50 mg·L －1 0.467 ±0.018##LPS+APS 100 mg·L －1 0.314 ±0.027##BAY11-7082(5 μmol·L －1)0.297 ±0.009

3.3 APS對心肌細胞IκBα蛋白表達的影響 Fig 2和Tab 3的結果顯示，同正常對照組比較，LPS模型組IκBα蛋白表達降低了45.8%;LPS+BAY11-7082組和APS中高劑量組同模型組相比，IκBα蛋白表達明顯回升(P＜0.01)，表明APS可能是通過抑制IκBα降解進而抑制NF-κB信號通路的激活達到對心肌細胞的保護作用;而BAY11-7082單用組的IκBα蛋白表達并無明顯變化。

Fig 2 Expression of IκBα in cultured neonatal rat cardiac myocytes

3.4 APS對心肌細胞TNF-α的影響 從Tab 5中可看出，同正常對照組比較，LPS模型組的TNF-α含量明顯增加(P＜0.01);而同模型組相比，LPS+BAY11-7082組和APS低中高劑量組TNF-α含量明顯減少，差異有顯著性(P＜0.01);BAY11-7082單用組中TNF-α含量并無明顯改變。

Tab 3 Effects of different treatment on IκBα expression in cultured ventricular myocytes of neonatal rats( ± s，n=6)

Tab 3 Effects of different treatment on IκBα expression in cultured ventricular myocytes of neonatal rats( ± s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS

Group A IκBα ∶A β-actin Normal 0.59 ±0.05 LPS(1 mg·L－1) 0.32 ±0.03＊＊LPS+BAY11(5 μmol·L －1) 0.51 ± 0.04##LPS+APS 25 mg·L －1 0.45 ±0.04#LPS+APS 50 mg·L －1 0.49 ±0.02##LPS+APS 100 mg·L －1 0.54 ±0.07##BAY11-7082(5 μmol·L －1)0.56 ±0.03

Tab 4 Effects of different treatment on TNF-α expression in cultured ventricular myocytes of neonatal rats(±s，n=6)

Tab 4 Effects of different treatment on TNF-α expression in cultured ventricular myocytes of neonatal rats(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS

Group TNF-α/ng·L －1 Normal 19.2 ±5.1 LPS 1 mg·L－1 77.4 ±4.5＊＊LPS+BAY11(5 μmol·L －1) 39.5 ±6.1##LPS+APS 25 mg·L －1 32.4 ±4.2##LPS+APS 50 mg·L －1 27.1 ±2.8##LPS+APS 100 mg·L －1 22.3 ±3.9##BAY11-7082(5 μmol·L －1)20.5 ±2.7

4 討論

心肌肥厚是由多種神經(jīng)體液調(diào)節(jié)，體內(nèi)多種細胞信號傳導途徑及基因參與調(diào)節(jié)的病理生理過程，是心臟對應激反應的一種代償機制。眾多研究表明，心肌肥厚是心衰的前期病變，是心衰、腦卒中、冠心病、猝死等的獨立危險因素［6］。近年來，許多研究表明炎癥因子的釋放對心肌肥厚有著重要的影響，尤其是TNF-α，可能在心臟損害過程中起了重要的作用［7］，在高血壓心臟病、冠心病和心力衰竭患者血清中均檢測到了升高的TNF-α。已有臨床研究表明，在高血壓伴左心室肥厚組的TNF-α含量明顯高于無心肌肥厚組，且與心肌肥厚指數(shù)呈正相關，這提示TNF-α在高血壓左心室肥厚的病理過程中起重要作用［8］。TNF-α可增加肌動蛋白和肌球蛋白重鏈的合成，造成心肌肥大。同時，它還可以與其它致心肌細胞肥大的因子如IL-1β、IL-6等共同作用，引起心肌細胞肥大，誘導心肌細胞發(fā)生凋亡［9－10］。因此，通過抑制心肌炎癥反應，降低炎癥因子的釋放，對心肌肥厚的研究和治療具有重要的意義。

TLR4受體是介導炎癥反應的跨膜受體，研究表明TLR4介導的信號通路在心衰、動脈粥樣硬化、心肌重構等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［11－12］。實驗發(fā)現(xiàn)，TLR4是介導 LPS信號轉導的門戶蛋白［13］。LPS是革蘭陰性菌細胞壁外膜的主要成分，其誘導的炎癥反應主要由TLR4來傳導。當TLR4與相應配體結合，進一步激活NF-κB，從而促進各種炎性細胞因子基因表達的激活［14］。Purcell等［15］的研究表明，NF-κB 是大鼠心肌細胞培養(yǎng)中心室肌細胞肥大生長所必需的，其本身過度表達可以誘導心肌細胞的肥大。在靜息細胞，IκBα蛋白通過其自身具有的一個特征性錨定蛋白與NF-κB二聚體結合在一起掩蓋NF-κB核定位信號，從而抑制NF-κB的活性，在接受外來刺激后，IκBα蛋白降解，與NF-κB解離，使 NF-κB活化，作用于靶基因，誘導基因表達，其結果就是大量促炎細胞因子如TNF-α過度表達，最終造成一系列炎癥反應及病癥。

本實驗中，LPS模型組的心肌細胞體積增加46.7%，蛋白含量增加66.0%，表明模型成功。在模型組中，心肌細胞 TLR4 mRNA表達增高，IκBα蛋白表達降低，TNF-α含量明顯增加，表明 LPS可能是通過TLR4受體使NF-κB活化，并促進炎癥因子的分泌，最終造成心肌細胞肥大。實驗中發(fā)現(xiàn)，APS處理組中，肥大心肌細胞的體積、蛋白含量均降低，TLR4 mRNA的表達降低，TNF-α的含量減少，IκBα蛋白含量回升，說明APS對LPS引起的心肌細胞肥大有明顯的抑制作用，且能有效降低TLR4的表達和炎癥因子的釋放，并呈一定的劑量依賴性，對心肌肥厚有一定的治療作用。而IκBα特異性阻斷劑 BAY11-7082對心肌細胞的肥大、炎癥因子TNF-α的含量及TLR4 mRNA的表達均有抑制作用，說明抑制IκBα降解，可有效抑制LPS引起的心肌細胞肥大，這同APS的效果相同，據(jù)此我們推測APS對肥大心肌細胞的保護作用很可能是通過抑制TLR4的表達，阻礙 NF-κB 活化，抑制 IκBα 降解和炎癥因子的釋放，最終達到抑制炎癥反應和心肌細胞肥大，保護心肌的目的。

心肌肥厚是一個復雜的病理過程，近年來有關TLR4對心肌肥厚、心衰的影響及黃芪多糖對TLR4表達影響等方面的研究均有報道，關于黃芪多糖在抑制心肌細胞肥大方面的研究甚少，本實驗通過研究黃芪多糖對TLR4-NF-κB信號通路的影響，探討了心肌細胞肥大的形成機制及黃芪多糖對心肌肥厚的保護作用機制，其具體的信號轉導通路及作用點仍待進一步的具體研究。

［1］閔 清，白育庭，余 薇，等.黃芪多糖對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(12):1661－4.

［1］Min Q，Bai Y T，Yu W，et al.Protective effects of Astragalus polysaccharide on cultured myocardial cells subjected to anoxia/reoxygenation injury in neonatal rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(12):1661－4.

［2］Liu C J，Cheng Y C，Lee K W，et al.Lipopolysaccharide induces cellular hypertrophy through calcineurin/NFAT-3 signaling pathway in H9c2 myocardiac cells［J］.Mol Cell Biochem，2008，313(1/2):167－78.

［3］Hernesniemi J，Lehtimaki T，Rontu R，et al.Toll-like receptor 4 polymorphism is associated with coronary stenosis but not with the occurrence of acute or old myocardial infarctions［J］.Scand J Clin Lab Invest，2006，66:667－75.

［4］路景濤，楊 雁，陳敏珠.黃芪多糖對細菌脂多糖誘導大鼠腹腔巨噬胞釋放TNF-α，NO及IL-1的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2004，39(2):139－41.

［4］Lu J T，Yang Y，Chen M Z.Effect of astragalus polysaccharides on IL-1，NO and TNFα secreted by lipopolysaccharide-induced normal rat peritoneal macrophages［J］.Acta Univer Med Anhui，2004，39(2):139－41.

［5］周振華，王洪新，趙素玲，等.黃芪多糖對脂多糖誘導大鼠心肌細胞肥大的保護作用［J］.中草藥，2012，43(3):524－8.

［5］Zhou Z H，Wang H X，Zhao S L，et al.Protection of astragalus polysaccharide on lipopolysaccharide-induced cardiac myocytes hypertrophy of rats［J］.Chin Tradit Herbal Drugs，2012，43(3):524－8.

［6］Hughes S E.The pathology of hypertrophic cardiomyopathy［J］.Histopathology，2004，44(5):412.

［7］Mann D L.Recent insights into the role of tumor necrosis factor in the failing heart［J］.Heart Fail Rev，2001，6(2):71－80.

［8］肖芝秀，張七一，王云英，等.腫瘤壞死因子-α與高血壓左心室肥厚的相關性研究［J］.中國醫(yī)刊，2007，42(6):29－30.

［8］Xiao X Z，Zhang Q Y，Wang Y Y，et al.A study on relation between tumor necrosis factor-α and essential hypertension and left ventricular hypertrophy［J］.Chin J Med，2007，42(6):29－30.

［9］Bradham W S，Bozkurt B，Gunasinghe H，et al.Tumor necrosis factor-alpha and myocardial remodeling in progression of heart failure:a current perspective［J］.Cardiovasc Res，2002，53(4):822－30.

［10］Feldman AM，Combes A，Wagner D，et al.The role of tumor necrosis factor in the pathophysiology of heart failure［J］.J Am Coll Cardiol，2000，35(3):537－44.

［11］Ha T，Li Y，Hua F，et al.Reduced cardiac hypertrophy in toll-like receptor 4-deficient mice following pressure overload［J］.Cardiovasc Res，2005，68:224－34.

［12］Timmers L，Sluijter J P，van Keulen J K，et al.Toll-like receptor 4 mediates maladaptive left ventricular remodeling and impairs cardiac function following myocardial infarction ［J］.Circ Res，2007，15:3256－98.

［13］Tapping R I，Akashi S，Miyake K，et al.Toll like receptor 4，but not Toll like receptor 2，is a signaling receptor for Escherichia and Sal monella lipopolysaccharides［J］.J Immunol，2000，165:5780－7.

［14］Yan Z Q.Regulation of TLR4 expression is a tale about tail arteriosclerosis［J］.Thromb Vasc Biol，2006，26(4):2582－ 4.

［15］Purcell N H，Tang G，Mercurio F，et al.Activation of NF-κB is required for hypertrophic growth of primary rat neonatal ventricular cardiomyocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98:6668－73.