李 覃，王 火，陳 虹，劉曉光，楊金娜，曹 波，高 穎

(1.天津武警后勤學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室，天津 300162;2.天津市職業(yè)與環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162;3.天津武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院，天津 300162;4.天津武警后勤學(xué)院生藥與藥劑學(xué)教研室，天津 300162)

金錢松(Pseudolarix kaempferi Gord)是中國特有植物，《本草綱目拾遺》第六卷木部記載:“汪連任采藥書，羅漢松一名金錢松，又名金松，其皮治一切血，殺蟲瘴癬，合蘆薈香油調(diào)擦”。土槿皮(也叫土荊皮)是金錢松的近根樹皮，外用治療皮膚癬癥已有悠久歷史，其中最主要的活性成分是土槿乙酸(pseudolaric acid B，PB)(Fig 1)［1］?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明，PB具有抗腫瘤、抗生育、抗血管生成、抗真菌等多種效應(yīng)［2］。此外，研究發(fā)現(xiàn)［3］PB 可發(fā)揮良好的免疫調(diào)節(jié)作用:5～10 μmmol·L－1的 PB即能明顯抑制正常人外周血T淋巴細(xì)胞活化增殖，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究進(jìn)一步通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)觀察PB對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答的干預(yù)作用，并初步探討其可能的分子機(jī)制，為充分利用金錢松資源及中藥土槿皮的深層次開發(fā)利用提供參考。

Fig 1 Structure of PB.C23H28O8，MW:432.46.

1 材料和方法

1.1 主要材料 PB由本室提取自土槿皮(經(jīng)中國藥品生物制品檢定所檢測(cè)純度＞98%)，溶于DMSO成1 mmol/L，濾過除菌，－20℃貯存。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)以RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(DMSO終濃度不高于0.1%)。二硝基氟苯(DNFB)、二硝基苯磺酸(DNBS)、MTT、絲裂霉素C購于Sigma公司;小鼠 Treg分析試劑盒購于 eBioscience公司;p38MAPK及其磷酸化抗體phospho-p38MAPK(Thr180/Tyr182)購于碧云天生物技術(shù)研究所;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購于Pierce公司。清潔級(jí)BALB/c小鼠(6～8周，1♀8～20 g)購于天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物模型的建立及給藥方法 參照Wang等方法［4］并略作調(diào)整建立遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayedtype hypersensitivity，DTH)小鼠模型，實(shí)驗(yàn)前1日小鼠腹部去毛約3 cm。開始日(第0日)和第1日于去毛部位涂0.5%DNFB(以4∶1丙酮橄欖油配制)40 μl致敏。第6日于左耳內(nèi)外側(cè)涂0.3%DNFB 20 μl激發(fā)。誘發(fā)前0.5 h和誘發(fā)后6 h小鼠左耳外涂PB乳膏(本室自制，藥物濃度分別為0.1%、0.2%和0.4%)。激發(fā)后48 h處死小鼠，用打孔器在相同部位取直徑8 mm耳片，游標(biāo)卡尺測(cè)量各組小鼠耳片厚度、電子天平稱重量，以耳片厚度(重量)差作為耳腫脹度。同時(shí)，另取一組模型小鼠外涂乳膏基質(zhì)作為對(duì)照以排除基質(zhì)的影響。

1.3 淋巴細(xì)胞增殖分析 參考文獻(xiàn)［5］制備DTH小鼠淋巴細(xì)胞懸液:小鼠眼球取血處死，無菌分離小鼠頸部、頜下、鎖骨下、腋窩等處淋巴結(jié)，200目篩網(wǎng)研磨過濾、洗滌，以RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%熱滅活FCS，100 U/ml青霉素–鏈霉素)調(diào)細(xì)胞濃度至1×109L，于 96 孔板中分別加入 100、50、25、12.5、6.25、3.125 nmol/L PB，37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h，在結(jié)束培養(yǎng)前4 ～6 h 加入 MTT(0.5 g·L－1)，再加入DMSO充分振蕩至細(xì)胞內(nèi)的紫藍(lán)色結(jié)晶完全溶解，以490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值(A490)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率/%=(對(duì)照組A均值－實(shí)驗(yàn)組A均值)/(對(duì)照組A均值－空白本底A均值)×100%。

1.4 抗原特異性 T細(xì)胞增殖分析 參照Niwa等［6］方法制備抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，簡(jiǎn)述如下:取正常小鼠脾細(xì)胞與等體積10 mmol/L DNBS(DNFB的可溶性類似物，可作為特異性抗原直接加入培養(yǎng)基中與APC耦合)混合，37℃處理30 min，棄上清，洗滌3次，再加入絲裂霉素C(50 μg/ml)培養(yǎng)30 min。同時(shí)，無菌制備并純化DNFB致敏小鼠的T淋巴細(xì)胞(5×108·L－1)，與上述制備好的 APC(5×108·L－1)共培養(yǎng)72 h，加入不同濃度PB進(jìn)行干預(yù)，按前述MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù) 按前述收集、純化各組小鼠淋巴結(jié)T細(xì)胞［7］，以標(biāo)記緩沖液洗滌 3次(2 000 r·min－1，5 min/次)，根據(jù)試劑盒說明，以抗-CD4 和抗-CD25抗體進(jìn)行表面標(biāo)記，4℃，避光孵育30 min，洗滌3次，固定、破膜后加入抗Foxp3及相應(yīng)的同型對(duì)照，4℃，避光孵育30 min，洗滌后以標(biāo)記緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，San Jose，CA)上機(jī)分析。采用FlowJo software(tree star，san carlos，CA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 Western blot檢測(cè)p38MAPK的磷酸化活性表達(dá) 收集各組小鼠淋巴結(jié)，提取組織蛋白，Bradford法定量蛋白含量，SDS-PAGE電泳，半干法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(Phosphop38MAPK，1 ∶1 000)孵育，4℃過夜，TBST 洗膜后以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL法檢測(cè)。用Stripping Solution洗脫、封閉后，再次加入一抗(p38MAPK，1∶1 000)、二抗，顯影。采用BioRad系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果

2.1 PB抑制小鼠DTH應(yīng)答 與模型組小鼠相比(Fig 2)，透皮給藥的各劑量PB均明顯抑制小鼠耳腫脹度，耳片厚度差和重量差均明顯下降，且呈一定的劑量依賴性。鑒于低劑量PB即能顯示出良好的抑制活性，因此后續(xù)研究選擇0.1%PB進(jìn)行機(jī)制探討。此外，乳膏基質(zhì)對(duì)小鼠未見明顯影響(數(shù)據(jù)未顯示)。

Fig 2 Topical treatment with PB suppressed DTH response

2.2 PB抑制DTH小鼠脾淋巴細(xì)胞體外增殖 如Fig 3所示，DTH小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外仍保持了較高的增殖能力，PB干預(yù)后能夠顯著抑制淋巴細(xì)胞增殖，提示其對(duì)高反應(yīng)性的淋巴細(xì)胞亦具一定的免疫抑制作用。

2.3 PB抑制抗原特異性T淋巴細(xì)胞體外增殖本研究通過特異性抗原DNBS刺激DNFB致敏小鼠的T淋巴細(xì)胞，檢測(cè)PB對(duì)抗原特異性T細(xì)胞體外增殖的影響。Fig 4顯示，PB能夠明顯抑制特異性T淋巴細(xì)胞的體外增殖，且呈一定的劑量依賴性關(guān)系。

Fig 3 Inhibitory effect of PB on the growth of lymphocytes

Fig 4 Inhibitory effect of PB on the growth of antigen-specific T lymphocytes

2.4 PB促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Treg產(chǎn)生 流式細(xì)胞術(shù)分析可見(Fig 5)，0.1%PB干預(yù)DTH小鼠后，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞從約2.5%上升至約2.9%，接近正常水平，與模型對(duì)照組相比差異具有顯著性，提示 PB能夠通過促進(jìn) CD4+CD25+Foxp3+Treg產(chǎn)生發(fā)揮免疫抑制作用。

2.5 PB上調(diào) Phospho-p38MAPK表達(dá) Western blot結(jié)果顯示(Fig 6)，DTH模型組 Phospho-p38 MAPK(p-p38MAPK)蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高，PB能夠進(jìn)一步上調(diào)p38 MAPK蛋白的磷酸化活性表達(dá)，同時(shí)非磷酸化p38 MAPK表達(dá)無變化。

3 討論

免疫抑制劑可通過影響人體的免疫應(yīng)答和免疫病理反應(yīng)發(fā)揮相應(yīng)的藥理學(xué)效應(yīng)，多用于防治免疫功能異常所致的疾病。目前常用的免疫抑制劑因副作用較大而限制了其臨床應(yīng)用。隨著免疫藥理學(xué)、免疫生物學(xué)、循證醫(yī)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，人們致力于尋找免疫抑制作用更強(qiáng)、不良反應(yīng)更低的新型免疫抑制劑。傳統(tǒng)中藥土槿皮有止癢殺蟲的功能，屬《中華人民共和國藥典》收載的常用中藥，其有效成分PB為二萜酸類化合物，具有獨(dú)特的二萜母核以及內(nèi)酯環(huán)和共軛雙烯酸側(cè)鏈［8］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，3.125～100 nmol/L PB體外作用能夠明顯抑制正常小鼠T細(xì)胞活化增殖且具毒性較低(數(shù)據(jù)未顯示)，本文進(jìn)一步研究其對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答的影響。

Fig 5 Effect of PB on the generation of Treg

Fig 6 Effect of PB on phosphorylated-p38MAPK expression

DTH是皮膚接觸特異性抗原后產(chǎn)生的遲發(fā)型超敏反應(yīng)，采用DNFB建立小鼠耳廓DTH模型是目前學(xué)界最常用的評(píng)價(jià)藥物免疫抑制活性的動(dòng)物模型之一。許多研究已經(jīng)證實(shí)，抗原特異性T細(xì)胞及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答異常在DTH反應(yīng)的中扮演重要角色，該模型以小鼠耳廓作為皮炎的靶部位，可以根據(jù)炎癥耳廓的厚度來判斷藥物療效［9］。因此，本研究首先通過小鼠DTH模型探討PB的藥物效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PB能有效抑制DTH小鼠耳腫脹度，提示其可通過下調(diào)機(jī)體T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答發(fā)揮免疫抑制作用，且較陽性藥物地塞米松具有更優(yōu)越的安全性(數(shù)據(jù)未顯示)。接著，進(jìn)一步檢測(cè)了PB對(duì)DTH小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖的影響，結(jié)果顯示藥物體外干預(yù)亦能明顯抑制體內(nèi)已被激活的淋巴細(xì)胞增殖，有助于阻止其再次接觸同種抗原刺激后的活化增殖。隨后，通過DNBS特異性刺激DNFB致敏小鼠的T淋巴細(xì)胞，觀察到PB明顯抑制抗原特異性T細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與下調(diào)IL2產(chǎn)生有關(guān)，進(jìn)而抑制T細(xì)胞活化，使其停留在G0早期［10］。本研究結(jié)果對(duì)于篩選/評(píng)價(jià)藥物的免疫干預(yù)作用、設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療方案具有一定意義。

1995年，Sakaguchi等［11］首次發(fā)現(xiàn)機(jī)體中存在一類具有免疫無能和免疫抑制兩大特性且高表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞，并將這類細(xì)胞稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)。此外，有研究顯示過激的免疫應(yīng)答(如DTH)不僅有效應(yīng)性T細(xì)胞的活化，而且還伴隨著Treg的形成，Treg和效應(yīng)細(xì)胞之間的平衡是免疫系統(tǒng)控制免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。新近證實(shí)［12］，抗炎劑的確可以通過誘導(dǎo) Treg減輕小鼠DTH反應(yīng)。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分析了DTH小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示0.1%PB能夠明顯增加Treg產(chǎn)生，從而在體內(nèi)發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，干預(yù)DTH反應(yīng)。

有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，其中p38MAPK主要參與炎癥和促炎癥細(xì)胞因子的分泌［13］。最近，Huber等［14］提出新觀點(diǎn)，Treg可以激活p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮免疫抑制作用，抑制p38MAPK活化則能防止CD4+CD25－T細(xì)胞分化為Treg。Adler等［15］的研究結(jié)果亦表明，激活p38MAPK在誘導(dǎo)免疫無能和維持Treg的免疫抑制功能的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，p38MAPK抑制劑則阻斷Treg的抑制活性，p38MAPK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)Treg抑制功能中的重要作用可見一斑。本研究結(jié)果表明，PB體內(nèi)干預(yù)后可以增加 DTH小鼠 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)明顯上調(diào) p38 MAPK蛋白的磷酸化活性表達(dá)水平。然而，2009年，Li等［3］報(bào)道，PB體外作用能夠抑制正常人外周血T淋巴細(xì)胞活化增殖，其作用機(jī)制可能與下調(diào)MAPK信號(hào)通路有關(guān)。造成PB對(duì)p38 MAPK呈雙向調(diào)節(jié)作用的原因或許與體內(nèi)外微環(huán)境的差異、給藥途徑以及機(jī)體狀態(tài)等多種因素有關(guān)。雖然本研究發(fā)現(xiàn)PB可能通過上調(diào)p38MAPK信號(hào)分子促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Treg產(chǎn)生，但是有關(guān)PB對(duì)Treg的外周誘導(dǎo)及其與其它Treg細(xì)胞亞群之間的關(guān)系等方面還有許多重要問題尚需解答，其具體作用靶點(diǎn)亦未完全揭示，相關(guān)研究的不斷深入對(duì)于明確PB的免疫干預(yù)機(jī)制以及防治免疫相關(guān)性疾病的新藥開發(fā)均具重要意義。

總之，本研究初步探討了傳統(tǒng)中藥有效成分PB對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)效應(yīng)及其可能的作用機(jī)制，希望能為開發(fā)高效低毒的新型免疫抑制藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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