吳 穎，孫 冰，肖 靜，孫桂波，呂圭源，李 明，陳素紅，孫曉波

(1.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院浙江溫州 325035;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所北京 100193;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所浙江杭州 310053)

由內(nèi)毒素引起的炎癥性疾病是由局部病原菌感染，而最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生全身系統(tǒng)性反應(yīng)。可引起心肌收縮力減弱，心肌受損，嚴(yán)重影響心臟功能。內(nèi)毒素可激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，釋放出腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-1β)等許多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞、組織、器官的損傷［1］。

中藥三七是我國的傳統(tǒng)珍貴藥材，具有止血、散瘀、消腫、止痛等功效，其以三七或總皂苷制成的制劑在臨床上廣泛用于心、腦血管疾病的治療［2］。三七皂苷R1屬于原人參三醇型，是三七中最具有代表的特征性化合物，具有廣泛的藥理作用，已作為冠心丹參滴丸的主要成分用于治療心肌缺血性疾病［3］。抗炎是三七皂苷R1的重要藥理作用之一，以往研究已證實(shí)三七皂苷R1對防治血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有較好療效［4-5］，但關(guān)于 R1保護(hù)心肌損傷的藥理機(jī)制研究較少。本研究采用內(nèi)毒素脂多糖LPS(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)小鼠心肌損傷，建立急性內(nèi)毒素心肌損傷模型［6］。現(xiàn)已證實(shí)，LPS能刺激NF-κB的活化，進(jìn)而啟動(dòng)VCAM-1和 ICAM-1的表達(dá)而參與心肌損傷的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過檢測相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平及在心肌組織中的浸潤情況，從而闡明中藥三七有效防治心肌損傷的藥理基礎(chǔ)和物質(zhì)基礎(chǔ)，為三七有效防治心肌損傷疾病提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6J小鼠，♂，8～12周齡，質(zhì)量(23±2)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為6組，每組5～8只:正常對照組(CTRL組)、模型組(LPS組)、預(yù)處理低劑量組(L+R1低組)、預(yù)處理中劑量組(L+R1中組)、預(yù)處理高劑量組(L+R1高組)和陽性藥組(3-去氮腺苷，3-deazaadenosine，c3Ado組)或單給藥組(R1組)。分別預(yù)防性給與三七皂苷R1(5、12.5或25 mg·kg-1;ip)3 日后，注射 LPS(10 mg·kg-1，ip)，作用8 h。

1.2 藥品與試劑 三七皂苷R1，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;3-去氮腺苷、LPS，均購自Sigma公司;ED-1、CD-11b抗體，均購自 Abcam公司;IκBα、NF-κB 抗體，均購自 Santa Cruz 公司;ELISA試劑盒，購自達(dá)科為公司和逸峰生物公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為去離子水。

2 方法

2.1 超聲心動(dòng) C57BL/6J小鼠30只，每組5只，共6組。正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)處理4 d。LPS組腹腔注射生理鹽水，連續(xù)處理3 d后注射LPS(10 mg·kg-1，ip)，作用8 h，建立內(nèi)毒素心肌損傷模型。預(yù)處理組分別預(yù)防性給予三七皂苷 R1(5、12.5 或25 mg·kg-1，ip)，連續(xù)處理3 d 后注射LPS(10 mg·kg-1，ip)，作用8 h。陽性藥組預(yù)防性給予c3Ado(10 mg·kg-1，ip)，連續(xù)處理3 d后注射 LPS(10 mg·kg-1，ip)，作用 8 h。用 50 mg·kg-1的三溴乙醇進(jìn)行麻醉，備皮，超聲心動(dòng)測射血分?jǐn)?shù)(EF)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左心室收縮期內(nèi)徑(LVDs)、左心室舒張末期容積(LVVd)和左心室收縮末期容積(LVVs)［7-8］。

2.2 免疫組化分析 麻醉后灌流取心臟，經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后，切片(厚4～5 μm)，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗3次，抗原修復(fù)，以正常山羊血清室溫孵育20 min封閉，滴加稀釋一抗ED-1抗體(1∶400)，CD11b抗體(1 ∶400)。37℃孵育2 h，PBS液沖洗，HRP室溫孵育30 min，PBS液沖洗，DAB顯色，蒸餾水洗滌后以蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片［9］。顯微鏡下觀察，染色明顯的組織切片胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色定位明確的顆粒物質(zhì)為陽性細(xì)胞表達(dá)。250倍放大，圖像分析時(shí)每個(gè)切片取5個(gè)視野，剔除染色不均，皺褶圖像。

2.3 Western blot 低溫下將心臟組織剪碎，加入RIPA蛋白裂解液(含蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)快速勻漿、裂解、離心提取組織塊中總蛋白，用BCA法定量，95℃變性5 min。取等量樣本上樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上［10］。免疫反應(yīng):搖床上搖動(dòng)封閉1 h，然后加入 β-actin、IκBα 和 NF-κB 的一抗(均為1∶1 000稀釋)，4℃過夜。次日，室溫下TBST洗膜，二抗反應(yīng)1 h后洗膜、曝光顯影。以βactin作內(nèi)標(biāo)參考，灰度分析。

2.4 ELISA試劑盒 小鼠麻醉灌流取心臟，加入生理鹽水，用手術(shù)剪將組織剪碎，勻漿器勻漿。10 000 r·min-1，5 min離心取組織液上清。根據(jù)試劑盒說明書操作［11］，酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(A)值。

Tab 1 Cardiac function measured by echocardiography

3 結(jié)果

3.1 超聲心動(dòng)測小鼠心功能 超聲心動(dòng)結(jié)果顯示不同濃度的三七皂苷R1能有效地防止LPS引起的心肌功能的衰退，且其作用存在劑量依賴性。從射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)結(jié)果可以看出，與正常組相比，模型組的EF和FS都明顯降低，模型組心肌收縮功能明顯改變(P＜0.05);與模型組相比，三七皂苷R1高劑量組(25 mg·kg-1)處理后EF和FS明顯恢復(fù)(P＜0.05)，見Tab 1。

3.2 免疫組化分析ED-1+炎性細(xì)胞的浸潤 巨噬細(xì)胞作為心肌組織的主要炎癥浸潤細(xì)胞存在于許多原發(fā)和繼發(fā)性心臟疾病中。LPS刺激后，使巨噬細(xì)胞同血管內(nèi)皮細(xì)胞間粘附性加強(qiáng)，進(jìn)而透過血管內(nèi)皮，進(jìn)入心肌組織中，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)。對小鼠進(jìn)行ED-1(單核巨噬細(xì)胞特異性抗原)染色可以看出，與正常組相比，模型組心肌組織中單核巨噬細(xì)胞的量增加了2倍;與模型組相比，高劑量三七皂苷R1(25 mg·kg-1)預(yù)處理組中單核巨噬細(xì)胞的量明顯減少(P＜0.05)。R1明顯抑制了炎癥反應(yīng)中單核巨噬細(xì)胞在心肌細(xì)胞間的聚集。單給藥組與正常組相比無明顯差別，見Fig 1。

3.3 免疫組化分析CD11b+炎性細(xì)胞的浸潤 白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯增高是炎癥反應(yīng)的特征之一。正常情況下，CD11b(一種白細(xì)胞黏附因子)僅在單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞膜上呈低特異性表達(dá)，LPS刺激后，這些細(xì)胞被激活，通過與內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)相互作用而介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，繼而損傷組織。通過量化心肌組織中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞可反映小鼠炎癥情況。CD11b染色結(jié)果顯示，與正常組相比，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的量在LPS誘導(dǎo)后增加了14倍;與模型組相比，高劑量三七皂苷R1(25 mg·kg-1)預(yù)處理后，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的量降低到模型組的1/7，抑制了中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的大量增加，見Fig 2。

Fig 1 Immunohistochemical scoring of LPS-induced leukocyte accumulation within postcapillary venules of the heart after Notoginsenoside R1 treatment

Fig 2 Immunohistochemical scoring of LPS-induced leukocyte accumulation within postcapillary venules of the heart after Notoginsenoside R1 treatment

3.4 心肌中 IκBα 和 NF-κB活性的變化 通過Western blot法檢測心臟組織蛋白中IκBα和NF-κB的表達(dá)。如Fig 3A所示，LPS處理后2 h內(nèi)IκBα的表達(dá)隨時(shí)間降低。應(yīng)用三七皂苷R1后，可明顯抑制IκBα降解。與0時(shí)相比，在2 h內(nèi)IκBα的表達(dá)沒有明顯變化。由此可知，三七皂苷R1對LPS誘導(dǎo)的IκBα的降解有抑制作用。

如Fig 3B所示，LPS作用下，NF-κB p-65亞基的磷酸化明顯增多，應(yīng)用三七皂苷R1后抑制了NF-κB的活化。NF-κB是一種細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，通常以無活化形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，活化后廣泛參與炎癥反應(yīng)［12］。VCAM-1、ICAM-1基因的誘發(fā)依賴于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量三七皂苷R1(25 mg·kg-1)能阻斷NF-κB信號通路，抑制NF-κB活化入核，避免心肌細(xì)胞受到過量炎癥因子的影響，見Fig 3。

3.5 ELISA 測 TNF-α、IL-1β、VCAM-1 和 ICAM-1 腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細(xì)胞介素(IL-1β)是引起心肌損傷最重要的細(xì)胞因子。我們通過ELISA試劑盒的方法檢測TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)在LPS刺激2 h后有明顯的提升，8 h后回歸到正常水平。中劑量(12.5 mg·kg-1)、高劑量(25 mg·kg-1)的三七皂苷R1能有效抑制LPS刺激后TNF-α和IL-1β水平的升高，且其作用呈劑量依賴性(P＜0.05)。血管細(xì)胞黏附因子(VCAM-1)和細(xì)胞間黏附因子(ICAM-1)參與中性粒細(xì)胞黏附心肌細(xì)胞釋放細(xì)胞毒過程，在心肌損傷過程中起關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1也能抑制LPS處理后心肌組織中VCAM-1、ICAM-1的增長(P＜0.05)。單給藥組與正常組差異無顯著性。見Tab 2。

Fig 3 Effect of Notoginsenoside R1 on LPS-induced myocardial IκBα (A)and NF-κB(B)activation

Tab 2 TNF-α，IL-1β，VCAM-1 and ICAM-1 levels in cardiac tissue by ELISA(±s，n=8)

Tab 2 TNF-α，IL-1β，VCAM-1 and ICAM-1 levels in cardiac tissue by ELISA(±s，n=8)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs model.

Group TNF-α/ng·L-1 IL-1β/ng·L-1 VCAM-1/ng·L-1 ICAM-1/ng·L -1 Ctrl 42.5±6.6 36.2±0.2 89.9±9.4 74.1±16.4 LPS 376.3±14.6* 199.4±13.1*612.4±14.9*1049.2±17.7*LPS+R1 5 mg·kg-1 355.9±7.2 171.4±2.1# 572±23.7 994.5±29.3 LPS+R1 12.5 mg·kg-1 136.3±11.9# 87.8±5.5# 299.7±7.8# 329.1±2.9#LPS+R1 25 mg·kg-1 86.2±9.4# 41.6±6.5# 112.7±11.2# 99.7±14.6#Positive drug 48.1±12.5# 39.5±5.9# 109.6±10.6# 80.1±19.1#

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:LPS組小鼠心肌組織中TNF-α等炎癥因子以及CD11b等炎性細(xì)胞水平均升高，心肌收縮功能發(fā)生改變，提示內(nèi)毒素LPS可導(dǎo)致心肌細(xì)胞釋放炎癥因子，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤，最終導(dǎo)致心功能的下降。三七皂苷R1對心肌組織中TNF-α等炎癥因子的水平具有降低作用，能明顯抑制心肌組織中中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的大量浸潤，并明顯改善心功能，產(chǎn)生心臟保護(hù)作用。

近年研究表明，心臟移植、體外循環(huán)感染等因素可誘發(fā)機(jī)體內(nèi)內(nèi)毒素水平升高，引發(fā)心肌炎癥［13］。抑制炎癥因子的激活對于心肌損傷的防治有重要價(jià)值。過量炎性細(xì)胞因子之間相互作用產(chǎn)生網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，是心肌組織損傷的病理基礎(chǔ)之一。大量的中性粒細(xì)胞能釋放過量的炎癥因子和細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)，并吸引更多的中性粒細(xì)胞進(jìn)入組織，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致組織完全被破壞。文獻(xiàn)顯示，LPS刺激會(huì)使細(xì)胞因子VCAM-1和ICAM-1表達(dá)上調(diào)［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三七皂苷R1作用后能抑制以上細(xì)胞因子的表達(dá)，阻止局部中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的大量侵入。

三七皂苷R1能夠降低LPS處理之后心肌組織中升高的細(xì)胞因子TNF-α水平。TNF-α是一種自分泌的作用因子，在炎癥反應(yīng)中參與了心肌損傷的形成和發(fā)展，其表達(dá)水平在LPS刺激后增高，促進(jìn)了白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和相互作用，使粒細(xì)胞向炎癥區(qū)域的浸潤大大增加，從而導(dǎo)致心肌損傷［15］。巨噬細(xì)胞的激活使得心肌細(xì)胞中產(chǎn)生TNF-α，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出三七皂苷R1可以抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，防止心肌受損。因此推斷，TNF-α可能是一個(gè)直接可對心肌產(chǎn)生抑制作用的細(xì)胞因子。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1的作用是通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化來預(yù)防炎癥發(fā)生的?，F(xiàn)已證實(shí)，心肌梗死的過程中，NF-κB是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子和黏附因子表達(dá)的關(guān)鍵分子。梗死發(fā)生后，NF-κB激活轉(zhuǎn)移入核，與DNA鏈上的特異性部位結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)炎癥因子等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控 ICAM-1、VCAM-1、TNF-α 和 IL-1β 等炎癥因子的表達(dá)［16］。由此可預(yù)見，三七皂苷R1有可能用于治療因NF-κB的轉(zhuǎn)錄引起的病癥，如缺血/再灌注損傷、心肌細(xì)胞凋亡等。已有報(bào)道，NF-κB的抑制劑能夠有效治療內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)。抑制NF-κB的活化，將對心肌組織起到一定的保護(hù)作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)三七皂苷R1能夠阻止由內(nèi)毒素LPS引起的心肌收縮功能減弱，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，防止心肌損傷。我們可以嘗試將三七皂苷R1的抗炎特性開發(fā)作為組織受損、器官衰竭的抑制劑。因此，我們可以把三七皂苷R1應(yīng)用于預(yù)防由炎癥引起的心肌損傷，在臨床上具有一定應(yīng)用前景。

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