張孝云，紀(jì) 慶，代曉華，2，姜琳琳，熊冬生，周 圓

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，血液病醫(yī)院(血液學(xué)研究所)，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020;2.天津市口腔醫(yī)院暨南開大學(xué)附屬口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，天津 300041)

Survivin是一種腫瘤特異性凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis，IAP)家族的成員。與其它IAP成員不同，survivin選擇性表達(dá)于大多數(shù)腫瘤組織，但并不在成人正常組織中廣泛分布。Survivin的異常增高與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)，因此被認(rèn)為是特異性靶向腫瘤治療的理想靶點(diǎn)［1－2］。

目前靶向survivin的抑制劑主要集中在反義核酸，核酶，siRNA 序列等［3－5］，而小分子抑制劑還少見報(bào)道。Sun等［6］報(bào)道了survivin蛋白與其抑制性配體Smac/Diablo復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，為survivin小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究即基于此配體－受體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，利用計(jì)算機(jī)高通量篩選與化學(xué)信息學(xué)相結(jié)合的手段，尋找靶向survivin的小分子先導(dǎo)化合物，并對(duì)候選化合物的生物活性進(jìn)行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人白血病細(xì)胞株K562及其阿霉素耐藥細(xì)胞株K562/A02由本室長(zhǎng)期保存。RPMI 1640培養(yǎng)基干粉為Invitrogen公司產(chǎn)品;胎牛血清購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所科技公司。FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自BD pharmingen，碘化丙啶(PI)購自sigma公司。活性氧檢測(cè)試劑盒由碧云天公司生產(chǎn)。DOCK4.0程序由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)舊金山分校Kuntz實(shí)驗(yàn)室提供，計(jì)算機(jī)篩選后進(jìn)行生物活性檢測(cè)的化合物購自Specs公司。

1.2 三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及受體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)備 在 Unix和 Linux系統(tǒng)下，利用 Tripos公司SYBYL6.7軟件包中的spl編程語言結(jié)合其它自行研究的輔助程序，將收集來的Specs化合物二維數(shù)據(jù)庫文件自動(dòng)轉(zhuǎn)換為三維mol2格式的文件，其中包括加氫、加電荷和500步POWELL力場(chǎng)能量?jī)?yōu)化過程。從PDB晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中下載survivin蛋白BIR3區(qū)與配體 Smac/Diablo復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件(1XOX.pdb)，將其中的水分子及配體等雜原子除去，將所有的組氨酸His改為Hid，對(duì)生成二硫鍵的半胱氨酸Cys改為Cyx，經(jīng)InsightⅡ模擬及歸屬力場(chǎng)后，作為DOCK計(jì)算的初始結(jié)構(gòu)［7］。

1.3 負(fù)像的生成、對(duì)接及評(píng)分 根據(jù)配體－受體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，利用SYBYL軟件包給蛋白加氫和加電荷，使用DMS程序計(jì)算受體的溶劑可接觸表面［8］，用SPHGEN模塊通過填充不同大小剛性小球的方法來描述與配體－受體結(jié)合腔穴的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的立體特征，生成活性位點(diǎn)的負(fù)像。編寫dock.in文件確定各個(gè)參數(shù)文件位置，包括受體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件，活性位點(diǎn)負(fù)像數(shù)據(jù)文件，評(píng)分網(wǎng)格數(shù)據(jù)文件和配體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件及DOCK篩選時(shí)所需參數(shù)，然后在Linux下運(yùn)行DOCK模擬和篩選。用錨點(diǎn)搜索方法搜索數(shù)據(jù)庫中配體可能的最好構(gòu)象，根據(jù)能量打分的結(jié)果將數(shù)據(jù)排列起來。

1.4 初步生物學(xué)活性篩選 采用MTT法測(cè)定候選化合物對(duì)survivin高表達(dá)腫瘤細(xì)胞系的作用［9］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每孔18，000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后加入20 μl相應(yīng)濃度的化合物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，對(duì)照組加入等體積的生理鹽水。培養(yǎng)68 h后加MTT(每孔20 μl，工作濃度為5 g· L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時(shí)后，2 000 r·min－1離心10分鐘，棄上清后每孔加入100 μl DMSO，振蕩至沉淀完全溶解，酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定吸光度。按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.5 Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每孔5×105個(gè)接種到6孔板中過夜培養(yǎng)。各孔分別加入不同濃度的化合物作用一定時(shí)間，處理結(jié)束后，1 000r·min－1離心10 min收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗1次，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。取3×105細(xì)胞，1 000 r·min－1離心 10 min，棄上清，加 100 μl凋亡緩沖液，5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI，輕輕混勻，避光孵育 15 min，然后加入400 μl凋亡緩沖液，混勻，立即在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)［10］。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中活性氧變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔1×106個(gè)接種于6孔板過夜培養(yǎng)，70%～80% 融合貼壁后加入化合物進(jìn)行處理。處理組中加化合物作用不同的時(shí)間或不同劑量，同時(shí)設(shè)置不加化合物處理的對(duì)照組。用終濃度為10 μmol·L－1的 DCFH-DA染料室溫避光孵育20 min，然后用無血清培養(yǎng)液洗3次，最后用1 ml PBS將細(xì)胞重懸，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度［11］。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，每孔2×105個(gè)接種于6孔板中，置于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，70%融合貼壁后，用不同濃度的化合物進(jìn)行處理一定時(shí)間后收集細(xì)胞，5 ml PBS洗1次，1 200 r·min－1離心 5 min，棄上清，加入 70% 預(yù)冷甲醇固定，加入甲醇的同時(shí)渦旋混勻。冰上放置10 min，PBS 洗兩次，加入 150 μl 200 μg· L－1RNaseA，4℃孵育 15 min，加入 900 μl 50 mg·L－1PI，4℃孵育過夜，次日流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化，F(xiàn)lowjo軟件進(jìn)行分析。

1.8 受體與化合物作用模式的分子圖像學(xué)分析選擇活性較好的先導(dǎo)化合物，將含有其對(duì)接后的mol2文件取出，與去掉配體的受體文件同時(shí)用SYBYL軟件包打開，觀察其理論上與受體結(jié)合的最佳作用方式(藥效構(gòu)象)，分析化合物與受體之間的作用模式。

2 結(jié)果

2.1 計(jì)算機(jī)虛擬篩選結(jié)果 采用SPHGEN模塊在配體－受體結(jié)合部位填充大小不同的剛性小球，生成活性位點(diǎn)的負(fù)像。然后通過刪除重疊和分布不合理的圓球?qū)ω?fù)像進(jìn)行修改，余下圓球堆積成的負(fù)像作為活性區(qū)域特征的代表。將含有149，214個(gè)小分子的Specs三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫與活性區(qū)域進(jìn)行對(duì)接，從中挑選兩萬個(gè)與受體結(jié)合腔穴匹配最好的分子，進(jìn)一步選用多種具有代表性的打分函數(shù)進(jìn)行二次篩選。其中1000個(gè)高得分化合物的能量值在－82.18～－35.34 Kcal/mol范圍。我們將這1000個(gè)化合物通過結(jié)構(gòu)骨架進(jìn)行分類，并結(jié)合類藥性原則，從中挑選并購買了有代表性的35個(gè)化合物進(jìn)行生物學(xué)測(cè)試。這35個(gè)化合物的平均分子量為450.5(279.27～658.582)，其中分子量小于500的化合物占77%;氫鍵受體的平均值為5.8(2～11)，其中氫鍵受體少于9的化合物占94%;氫鍵供體的平均值為2(0～3);可旋轉(zhuǎn)鍵的平均值為8(3～14)，其中75%的化合物可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)目在3～9之間;ClogP的平均值為3.7(－0.96～6.21)，其中Clog P小于5.5的化合物占94%。

2.2 初步生物學(xué)活性測(cè)定 根據(jù)計(jì)算機(jī)篩選的結(jié)果，首先以survivin高表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為模型，對(duì)購買到的35個(gè)化合物進(jìn)行了初步生物學(xué)活性測(cè)定。結(jié)果表明35個(gè)化合物中有1-1、1-5、1-10、1-15、1-19、1-20、1-24、1-26、1-34 這九個(gè)化合物有明顯的抑制活性(IC50＜100 μmol·L－1)，其中 1-10、1-19、1-24 為代表的三類化合物 IC50在 30 μmol·L－1以下，以 1-19 最高(10.9 μmol·L－1)(Fig 1)。1-10、1-19、1-24的能量打分比較集中，范圍在－45.74～－43.07 Kcal/mol，類藥性分析顯示這3個(gè)化合物氫鍵供體數(shù)目為1～3，氫鍵受體數(shù)目為5～8，Clog P范圍為4.79～5.38。此外，我們還觀察了此3類化合物對(duì)survivin高表達(dá)的人白血病細(xì)胞K562及其耐藥細(xì)胞株K562/A02的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果表明，這3類化合物對(duì)K562及其耐藥細(xì)胞株也都具有明顯的抑制作用。而且與常規(guī)化療藥物阿霉素不同，survivin的小分子抑制劑對(duì)耐藥細(xì)胞K562/A02也有較好的抑制作用(Fig 2)。

Fig 1 Screening and structure of leading compounds

Fig 2 Growth inhibition of compounds 1-10，1-19 and 1-24 on K562 and K562/A02 cells

2.3 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo) MCF-7細(xì)胞用不同濃度的1-19化合物處理，24 h后收集細(xì)胞，用 Annexin VFITC和PI染色，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡測(cè)定。綜合分析3次以上獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，3.5 μmol·L－1和7 μmol·L－1的 1-19 處理 24 h 后細(xì)胞早期凋亡比例分別為5.12% 和9.45%，但是不同劑量處理后細(xì)胞晚期凋亡比例沒有明顯差異，說明化合物1-19能夠呈劑量依賴性誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞早期凋亡(Fig 3)。

Fig 3 Apoptosis induced by compound 1-19 in MCF-7 cells

2.4 化合物誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生S及G2/M期阻滯MCF-7細(xì)胞經(jīng)過1-19處理12 h后，可以觀察到G0/G1期細(xì)胞所占分?jǐn)?shù)下降，而S和G2/M期所占分?jǐn)?shù)增加。與未處理組相比，7 μmol·L－1的1-19誘導(dǎo) S期增加20%，G2/M期增加31.5%。在survivin高表達(dá)的K562及其耐藥細(xì)胞系K562/A02中，1-19同樣能夠誘導(dǎo)S期和G2/M期阻滯的發(fā)生。與未處理組相比，7 μmol·L－1的1-19處理12 h能夠使K562細(xì)胞 S期分?jǐn)?shù)增加9.2%，G2/M期分?jǐn)?shù)增加21.8%，K562/A02細(xì)胞S期分?jǐn)?shù)增加10.4%，G2/M期分?jǐn)?shù)增加47.5%(Fig 4)。

Fig 4 Effects of cell cycle arrest induced by compound 1-19

2.5 化合物誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧水平升高 本研究利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)。DCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成不易通透細(xì)胞膜的DCFH，從而被裝載到細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化生成有熒光的DCF。MCF-7細(xì)胞經(jīng) 3.5 μmol·L－1及 7 μmol·L－11-19 作用處理 30分鐘后，隨化合物濃度增加細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量持續(xù)遞增(Fig 5)，分別升高至對(duì)照組的2倍和3.3倍。

Fig 5 Effects of ROS production induced by compound 1-19

2.6 分子圖像學(xué)分析 通過分子圖像學(xué)方法，我們進(jìn)一步對(duì)化合物1-10、1-19及1-24與受體的相互作用模式進(jìn)行了分析。通過分析survivin蛋白的三維結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)在BIR受體結(jié)合區(qū)5埃范圍內(nèi)的氨基酸殘基為 THR48、LEU54、ALA55、GLN56、LYS62、GLU63、LEU64、GLU65、GLY66、TRP67、GLU68、ASP71、GLU76和 HIS80。如 Fig 6所示，化合物1-10、1-19和1-24都能夠很好的與survivin蛋白的受體結(jié)合腔穴結(jié)合，其中化合物1-10和1-24能夠與LYS62形成氫鍵，而1-19與1-10和1-24不同，它能夠通過與Asp71形成兩個(gè)穩(wěn)定的氫鍵而抑制survivin的作用。

Fig 6 Molecular graphic analysis of the compounds and survivin

3 討論

本研究基于survivin靶點(diǎn)蛋白與配體的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)化合物三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，利用分子對(duì)接技術(shù)將受體的結(jié)合腔穴與小分子三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配，并對(duì)這種對(duì)接的好壞進(jìn)行能量打分。為了提高打分的精度和速度，我們對(duì)最初DOCK篩選得分高的前20000個(gè)化合物采用具有代表性的打分函數(shù)重新進(jìn)行二次篩選，然后選擇前1000個(gè)化合物根據(jù)其骨架結(jié)構(gòu)和類藥性進(jìn)行分組。由于本研究的目的是選擇有潛在活性的先導(dǎo)化合物，為了不丟掉有活性的骨架結(jié)構(gòu)，我們?cè)诨衔镱愃幮缘脑瓌t上適度放寬，但是仍然保證大于70%的候選化合物滿足Lipinski的類藥性五原則。本研究挑選了35個(gè)化合物進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)試，初步生物學(xué)活性結(jié)果顯示其中有9個(gè)化合物有明顯的抑制活性(IC50＜100 μmol·L－1)，其中3 個(gè)化合物 IC50在30 μmol·L－1以下。此外，這3個(gè)化合物對(duì)survivin高表達(dá)的人白血病細(xì)胞K562及其阿霉素耐藥細(xì)胞株K562/A02都具有明顯的抑制作用。這一結(jié)果也表明，與傳統(tǒng)化療藥物相比，開發(fā)survivin抑制劑能夠在一定程度上克服腫瘤的多藥耐藥。

細(xì)胞凋亡是在一定生理或病理?xiàng)l件下細(xì)胞發(fā)生的主動(dòng)的程序性死亡過程。本研究篩選得到的先導(dǎo)化合物1-19能夠在較小劑量下誘導(dǎo)survivin高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸外翻，發(fā)生早期凋亡。有研究表明，survivin能夠通過抑制線粒體產(chǎn)生活性氧(ROS)來阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，針對(duì)survivin的小分子抑制劑1-19能夠在較低劑量下在30分鐘內(nèi)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的增加。這也提示著應(yīng)用survivin抑制劑可能能夠通過增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，在聯(lián)合化療增敏中發(fā)揮重要作用。

Survivin一個(gè)具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重功能的蛋白［12］，它主要表達(dá)于G2/M期。在腫瘤細(xì)胞中，這種周期依賴性表達(dá)以及其抗凋亡作用將有利于細(xì)胞逃離G2/M檢查點(diǎn)而發(fā)生凋亡耐受和持續(xù)增殖。本研究的結(jié)果顯示小分子化合物1-19能夠在多種survivin高表達(dá)的細(xì)胞中誘導(dǎo)S期和G2/M期阻滯的發(fā)生，而且在各種細(xì)胞中，G2/M阻滯增加的比例都要高于S期阻滯增加的比例。

受體與小分子化合物之間的作用是在三維空間進(jìn)行的。由于單鍵的旋轉(zhuǎn)，二者結(jié)合時(shí)小分子化合物會(huì)發(fā)生構(gòu)象的改變，稱為“藥效構(gòu)象”。通過分子對(duì)接進(jìn)行圖像學(xué)分析揭示小分子與受體之間的結(jié)合特征，可以從理論上探討小分子化合物的生物活性的本質(zhì)。62位LYS是survivin蛋白翻譯后修飾的重要氨基酸殘基，分子作用模式分析發(fā)現(xiàn)化合物1-10和1-24能夠與LYS62形成氫鍵，提示了化合物具有活性的內(nèi)在機(jī)制。化合物1-19是活性最高的化合物，其作用模式與1-10和1-24不同，它能夠與71位天門冬氨酸(Asp71)形成兩個(gè)穩(wěn)定的氫鍵，Asp71是survivin配體結(jié)合區(qū)的關(guān)鍵氨基酸殘基，其單個(gè)氨基酸的改變就可以使survivin的凋亡抑制活性轉(zhuǎn)變?yōu)榇俚蛲龌钚浴；衔?-19能夠與Asp71形成兩個(gè)穩(wěn)定的氫鍵也可能其表現(xiàn)出高活性的重要分子基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究基于survivin與其抑制性配體結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)，用分子對(duì)接的方法對(duì)小分子化合物的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行能量打分和篩選。通過進(jìn)一步生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和分子圖像學(xué)分析，初步確定了一個(gè)靶向survivin的先導(dǎo)化合物，為survivin小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

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