王 健，黃午陽，鄭其升，王興娜，李春陽

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科院國家獸用生物制品技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

TNF-α是一種由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子，可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，繼而產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如 ICAM-1、VCAM-1 等［1］，從而引起血管炎癥反應(yīng)。ICAM-1和VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族的成員，參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均有重要意義［2－3］。本文研究不同濃度TNF-α及不同刺激時間對于HUVEC中ICAM-1及VCAM-1蛋白變化的影響，確定最佳刺激量效及時效，驗證黏附蛋白在血管功能損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 新生胎兒臍帶(南京鼓樓醫(yī)院)，TNF-α、M199、膠原酶(Sigma公司)，胰酶，胎牛血清(Gibco)，ICAM-1、VCAM-1 ELISA 試劑盒、兔抗人 ICAM-1、VCAM-1 一抗、兔抗人IgG、鼠抗人β-actin一抗、鼠抗人IgG(博士德公司)，蛋白裂解液(碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代［4］新生胎兒臍帶用Ⅰ型膠原酶消化，M199完全培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)得一代HUVEC;胰酶消化傳代。

1.2.2 樣品制備 TNF-α 濃度為 0、1、5、10、20、30 μg·L－1刺激 4 h;隨即用最佳濃度的 TNF-α 分別刺激 0、1、2、4、6、8 h，得到樣品細(xì)胞。

1.2.3 ELISA 法測定細(xì)胞上清可溶性 ICAM-1、VCAM-1 蛋白含量 博士德ELISA試劑盒測定細(xì)胞上清，酶標(biāo)儀450 nm下測定OD值。

1.2.4 Western blot測定細(xì)胞中 ICAM-1、VCAM-1 蛋白含量

BCA試劑盒測定總蛋白含量，80 V，15 min和120 V，45 min進(jìn)行電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，37℃下孵育一抗、二抗各1 h，DAB顯色，拍照分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 濃度影響 ELISA法和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞上清和細(xì)胞中的ICAM-1和VCAM-1表達(dá)量均與TNF-α呈濃度依賴性關(guān)系。在濃度為10 μg·L－1時，兩者上清液表達(dá)量達(dá)到最高值(3.399±0.320)μg·L－1、(0.719±0.050)μg·L－1;ICAM-1/β-actin 和 VCAM-1/β-actin 相對表達(dá)量也達(dá)到最高，相比對照組差異均有顯著性(P＜0.01)。此外，TNF-α 濃度為 5 μg·L－1和 20 μg· L－1時，ICAM-1 和VCAM-1表達(dá)量都與對照組差異有顯著性(P＜0.05)。

2.2 時間影響 采用最佳濃度(10 μg·L－1)的 TNF-α 刺激HUVEC不同時間。正常細(xì)胞上清中兩種蛋白表達(dá)量較低。隨著刺激時間的增長，ICAM-1和VCAM-1蛋白含量增加。在刺激6 h時兩種上清蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值，約為正常組的10倍(P＜0.05)。同時細(xì)胞中 ICAM-1/β-actin和VCAM-1/β-actin相對表達(dá)量也達(dá)到最高，與正常細(xì)胞差異有顯著性(P＜0.01)。此外，刺激時間為 2、4 h時，ICAM-1、VCAM-1相對表達(dá)量也與正常細(xì)胞差異有顯著性(P＜0.05)。

3 討論

近年來，研究者致力于研究細(xì)胞炎癥模型，尋求抗心血管疾病藥物。TNF-α作為炎癥因子焦點，能刺激相應(yīng)的細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、VCAM-1，增強與白細(xì)胞的黏附性，引起血管炎癥性反應(yīng)［5］。鑒于應(yīng)用的廣泛性，我們對細(xì)胞模型進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)TNF-α濃度為10μg·L－1及刺激6h時，兩者表達(dá)量均達(dá)到峰值。這為我們研究藍(lán)莓花青素錦葵色素抗炎作用提供了實驗基礎(chǔ)。

Tab 1Effect of different concentration and mediated time of TNF-α on expression of ICAM-1 and VCAM-1 in HUVEC(±s，n=3)

Tab 1Effect of different concentration and mediated time of TNF-α on expression of ICAM-1 and VCAM-1 in HUVEC(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Protein in supernatant/μg·L －1-actin Concentration/μg·L－1 0 0.312 ±0.100 0.062 ±0.035 1.393 ±0.180 0.472 ICAM-1 VCAM-1 Protein in cell ICAM-1/β-actin VCAM-1/β±0.040 1 0.942 ±0.250 0.244 ±0.048* 2.921 ±0.320* 0.960 ±0.125*5 2.220 ±0.260* 0.632 ±0.062* 2.928 ±0.280* 0.997 ±0.150*10 3.399 ±0.320＊＊ 0.719 ±0.050＊＊ 2.983 ±0.200＊＊ 1.390 ±0.120＊＊20 2.988 ±0.318* 0.518 ±0.072* 2.322 ±0.250* 1.190 ±0.137*30 2.794 ±0.289* 0.460 ±0.070* 2.247 ±0.220* 0.985 ±0.113*Time/h 0 0.402 ±0.110 0.128 ±0.050 0.164 ±0.007 0.237 ±0.008 1 0.941 ±0.269 0.462 ±0.055 0.321 ±0.010＊＊ 0.344 ±0.012*2 2.210 ±0.210* 0.588 ±0.066* 0.338 ±0.022＊＊ 0.325 ±0.016*4 2.998 ±0.420* 0.897 ±0.065* 0.424 ±0.015＊＊ 0.341 ±0.021*6 3.399 ±0.367＊＊＊ 1.094 ±0.069＊＊ 0.536 ±0.012＊＊ 0.383 ±0.022＊＊8 2.794 ±0.405* 0.848 ±0.066* 0.477 ±0.016＊＊0.262 ±0.025

［1］丁偉斌，梁 統(tǒng)，周克元.原花青素二聚體B2對大鼠滑膜細(xì)胞NF-κB核轉(zhuǎn)運及炎癥因子表達(dá)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28(6):803－6.

［1］Ding W B，Liang T，Zhou K Y.Effect of procyanidin dimerB2 on NF-κB nucleus transfer and expression of inflammatory cytokines in rat synovial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(6):803－6.

［2］Rahman A，F(xiàn)azal F.The role of endothelial ICAM-1 in leukocyte transmigration［J］.Antioxi Redox Signal，2009，11:823 －39.

［3］Chai H，Wang Q Y，Huang L F，et al.Ginsenoside Rb1 inhibits tumor necrosis factor-α-induced vascular cell adhesion molecule-1 expression in human endothelial cells ［J］.Biol Pharm Bull，2008，31:2050－6.

［4］Huang W Y，Chakrabart S，Majumder K，et al.Egg-derived peptide IRW inhibits TNF-α-induced inflammatory response and oxidative stress in endothelial cells［J］.J Agr Food Chem，2010，58:10840－6.

［5］張 麗，梁中琴，顧振綸.姜黃素抑制TNF-α誘導(dǎo)的BMEC與白細(xì)胞的粘附［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(1):63－7.

［5］Zhang L，Liang Z Q，Gu Z L.Curcumin inhibits the adherence of leuleocytes to BMECs induced by TNF-α ［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):63 －7.