周 紅，梁小燕，吳志遠(yuǎn)，戚曉紅

(南京醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心、2.病理生理學(xué)系，江蘇南京 210029;3.新加坡國(guó)立大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，新加坡 117597)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是以動(dòng)脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞和膠原增殖、泡沫細(xì)胞形成為主要特征的廣泛性動(dòng)脈病變［1］。高膽固醇血癥被認(rèn)為是導(dǎo)致AS的關(guān)鍵因素，尋找有效的調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇代謝的藥物治療動(dòng)脈粥樣硬化也因此成為這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［2］。研究顯示，硫化氫(hydrogen sulphide，H2S)作為第三種氣體信號(hào)分子，具有抗炎［3］、抗氧化［4］作用，能抑制細(xì)胞黏附分子的表達(dá)［5］，阻止巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞［6］，抑制氧化型低密度脂蛋白的表達(dá)［7］。因此，H2S被認(rèn)為具有潛在的抗AS作用。然而，H2S是否對(duì)脂代謝產(chǎn)生影響還不清楚。本課題通過(guò)建立大鼠AS模型，研究H2S對(duì)膽固醇代謝的影響，進(jìn)一步探討其抗AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康♂ SD大鼠24只，清潔級(jí)，體質(zhì)量(250±10)g，購(gòu)于江蘇省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(CG)、模型組(MG)和模型+硫氫化鈉組(NaHS)，每組8只。實(shí)驗(yàn)前，將動(dòng)物置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)7 d。室溫(22±2)℃，12 h光照/12 h黑暗，動(dòng)物自由取食和飲水。

1.2 藥品和試劑 NaHS、油紅O、對(duì)苯二胺硫酸鹽購(gòu)于Sigma公司，膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶購(gòu)于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，維生素D3(Vit D3)購(gòu)于上海通用藥業(yè)股份有限公司(批號(hào):090903)，TRIzol購(gòu)于Invitrogen，RT-PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，引物由上海生工合成，余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 Thermo PCR儀，Leica冰凍切片機(jī)，日立7600-020全自動(dòng)生化分析儀，Nikon光學(xué)顯微鏡，美國(guó)SONICS超聲粉碎儀。

1.4 模型制備與給藥方法 采用高脂飼料加Vit D3方法復(fù)制大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。模型組和硫氫化鈉組給予高脂飼料(標(biāo)準(zhǔn)飼料配方中加2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%豬油、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶)，于喂養(yǎng)前和喂養(yǎng)后第3、6、9周腹腔注射Vit D3(3×105IU·kg－1)各1次。同時(shí)硫氫化鈉組每日腹腔注射 NaHS 56 μmol·kg－1，連續(xù)給藥 12周。對(duì)照組給予普通飼料及腹腔注射生理鹽水。

1.5 標(biāo)本采集 各組動(dòng)物于喂養(yǎng)前眼眶取血。模型制備完成后，頸總動(dòng)脈插管取血，3 000 r·min－1離心10 min，分離血清，－80℃保存?zhèn)溆?。新鮮肝組織一部分經(jīng)液氮后－80℃保存，一部分甲醛固定，用于冰凍切片。

1.6 血脂檢測(cè) 取血清上樣于日立全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血總膽固醇(total cholestorol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholestorol，HDL-Ch)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholestorol，LDL-Ch)。1.7 組織學(xué)染色 油紅O染色:冰凍切片厚10 μm，加入油紅O染色液，避光染色60 min，60%異丙醇分化數(shù)秒，水洗，蘇木精染5～10 s，1%鹽水酒精分化1～2 s，自來(lái)水洗10 min，風(fēng)干后明膠甘油封片。

1.8 肝組織膽固醇水平檢測(cè) 按文獻(xiàn)［8］方法取大鼠肝組織勻漿，經(jīng)氯仿 ∶甲醇(2∶1)稀釋、振蕩過(guò)夜、4 500 r·min－1離心 10 min、通風(fēng)櫥風(fēng)干、叔丁醇/叔丁基乙醇X-114/甲醇混合液溶解后，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定TG含量。

1.9 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(鏈霉素和青霉素)的DMEM培養(yǎng)基中。于5%CO237℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。NaHS 100 μmol·L－1作用于 HepG2 細(xì)胞6 h［5］后用于檢測(cè)羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(hydroxy-methyl-glutarylcoenzyme A Reductase，HMGCoA Reductase)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)。

1.10 RT-PCR HepG2細(xì)胞用滅菌PBS沖洗兩次后，按常規(guī)方法提取總RNA，并用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)量RNA濃度及純度，A260/280比值1.8～2.0。逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒說(shuō)明操作。HMGCoA Reductase引物序列為:正義鏈5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'，反義鏈5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3';LDLR引物序列為:正義鏈 5'-CAATGTCTCACCAAGC TCTG-3'，反義鏈 5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3';內(nèi)參 GAPDH正義鏈5'-CCCATCACCATCTTCC AG-3'，反 義 鏈 5'-ATGACCTTGCCCACAGCC-3'。PCR 反應(yīng)條件為:98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物加樣于2%瓊脂糖凝膠中，電泳后在凝膠成像分析系統(tǒng)中分析目的基因產(chǎn)物條帶的灰度值與內(nèi)參PCR產(chǎn)物條帶的比值。

2 結(jié)果

2.1 血清血脂水平 血清TC、TG、HDL-Ch和LDLCh含量在喂養(yǎng)前各組間無(wú)變化(Tab 1)。喂養(yǎng)12周后，模型組血清TC和LDL-Ch較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，HDL-Ch亦升高(P＜0.05);NaHS組血清各指標(biāo)較模型組降低(P＜0.05)。

Tab 1Lipid levels in blood serum(mmol·L－1，±s，n=8)

Tab 1Lipid levels in blood serum(mmol·L－1，±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

3 months before 3 months after CG MG NaHS TC 2.58±0.24 2.17 ±0.23 2.36±0.31 2.03±0.49 8.49±3.84＊＊ 6.20±3.21 CG MG NaHS#TG 0.83±0.17 0.75 ±0.23 0.73±0.15 1.17±0.50 1.38±0.96 0.47±0.22#HDL-Ch 1.64±0.18 1.41 ±0.15 1.56±0.22 1.12±0.13 1.88±0.68* 1.44±0.28#LDL-Ch 0.62±0.09 0.66 ±0.06 0.67±0.13 0.55±0.09 5.73±2.9＊＊ 3.63±2.92#

2.2 肝組織膽固醇水平 喂養(yǎng)12周后，對(duì)照組大鼠肝臟膽固醇含量為每克肝組織(1.65±0.21)mg;模型組為(4.74±0.58)mg，較對(duì)照組明顯增高(P＜0.01);模型+NaHS組為每克肝組織(3.91±0.40)mg，較模型組降低，差異有顯著性(P＜0.01)。

2.3 肝油紅O染色 肝油紅O染色顯示(Fig 1)，與對(duì)照組比，模型組肝細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯增多，NaHS組明顯改善，僅有輕微脂質(zhì)。

2.4 HepG2 細(xì)胞內(nèi) HMGCoA Reductase、LDLR mRNA 的表達(dá) 100 μmol·L－1NaHS作用于HepG2細(xì)胞6 h后，HMGCoA R的mRNA表達(dá)較對(duì)照組下降(Fig 2A)，差異有顯著性(P＜0.01);而LDLR mRNA的表達(dá)較對(duì)照組升高(Fig 2B)，差異有顯著性(P＜0.05)。

3 討論

Fig 1 Oil red O staining of hepatic tissues(×100)

Fig 2 Expression of HMG CoA reductase and LDL receptor in HepG2 cells(n=8)

關(guān)于H2S對(duì)AS的作用已有報(bào)道。Wang等［5］研究發(fā)現(xiàn)，抑制內(nèi)源性H2S的產(chǎn)生，可使ApoE敲除鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊增多，而外源性H2S可以緩解AS的病程。有報(bào)道H2S對(duì)AS有明顯保護(hù)作用，并能明顯下調(diào)血脂水平［9］，但其具體機(jī)制及作用環(huán)節(jié)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)AS模型大鼠和肝HepG2細(xì)胞給予外源性H2S，觀察其對(duì)膽固醇代謝的影響，并探究其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2S能降低AS大鼠血清TC、LDL-Ch水平和肝臟TC含量，提示H2S對(duì)膽固醇的代謝有一定作用。

人體膽固醇代謝受到膽固醇合成與吸收的雙重調(diào)節(jié)，其來(lái)源有兩種途徑:一種是在關(guān)鍵限速酶HMGCoA Reductase作用下，由 3-甲基-3，5-二羥基戊酸合成乙酰輔酶A，再完成內(nèi)源性膽固醇生物合成;另外一種途徑是外源性的，食物中的膽固醇被小腸上皮細(xì)胞吸收后和LDL結(jié)合形成復(fù)合體，通過(guò)和肝細(xì)胞膜上豐富的LDL受體結(jié)合，完成膽固醇的細(xì)胞內(nèi)吞噬作用。

HMGCoA Reductase是膽固醇合成的限速酶，各種因素對(duì)膽固醇合成的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)對(duì)HMGCoA Reductase活性的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)的［10］。為了探究H2S調(diào)節(jié)膽固醇合成代謝的機(jī)制，我們首先觀察了H2S對(duì)肝HepG2細(xì)胞HMGCoA Reductase的影響。結(jié)果顯示，H2S能降低HepG2細(xì)胞中HMGCoA Reductase mRNA的表達(dá)，提示H2S能在轉(zhuǎn)錄水平抑制HMGCoA Reductase活性，繼而抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成。

膽固醇在體內(nèi)代謝的主要去路是在肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)化成膽汁酸。血液中70%的膽固醇由LDL和極低密度脂蛋白(VLDL)攜帶，其中90%LDL是通過(guò)LDLR途徑清除的，肝臟是受體介導(dǎo)的LDL-Ch清除發(fā)生的主要場(chǎng)所，約50%的LDL在肝降解。LDLR是一種跨膜糖蛋白，在維持血漿膽固醇水平恒定中發(fā)揮重要作用［11］，主要功能是參與LDL的分解代謝，可介導(dǎo)血中2/3的LDL進(jìn)入肝細(xì)胞降解。當(dāng)LDLR數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)及功能異常時(shí)，血漿膽固醇水平增高，并在組織內(nèi)過(guò)度淤積，最終導(dǎo)致AS斑塊形成。

為了探究H2S對(duì)膽固醇分解代謝的影響，我們進(jìn)一步觀察了H2S對(duì)肝HepG2細(xì)胞LDLR的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2S能使HepG2細(xì)胞中LDLR mRNA的表達(dá)增加，提示H2S能增加肝LDLR表達(dá)，有助于清除血液中的LDL，降低血液LDL水平。

綜上，研究結(jié)果顯示H2S對(duì)AS膽固醇代謝具有調(diào)節(jié)作用，能抑制肝HMGCoA Reductase表達(dá)，使內(nèi)源性膽固醇合成下降;并上調(diào)肝臟LDLR表達(dá)，促進(jìn)膽固醇在肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化，從而降低血漿總膽固醇水平。但H2S影響膽固醇代謝的信號(hào)通路和具體的作用環(huán)節(jié)尚需進(jìn)一步研究。

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