黃遠(yuǎn)鏗,肖百全,歐慧瑜,韓 重,楊 威
(廣州醫(yī)藥研究總院藥物非臨床評價研究中心,廣東廣州 510240)
出血是外科手術(shù)和外傷中最常見、最難控制的問題之一,特別是重要臟器的出血,如肝臟、脾臟、腎臟破裂出血常常直接威脅生命。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全世界因交通事故而死亡的人數(shù)已超過3 000萬人,中國車禍的發(fā)生率和死亡率皆居世界之首位,而內(nèi)臟出血又是車禍較嚴(yán)重又常見的癥狀之一。另外,據(jù)美軍的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn):陣亡將士中有90%死在被送到醫(yī)院之前,其中1/2死于大出血,1/4在負(fù)傷5~10 min內(nèi)就送了命[1]。傳統(tǒng)的止血方式如結(jié)扎、壓迫止血和藥物促凝止血曾經(jīng)拯救過千千萬萬的出血患者,但這些方式也具有較大的缺陷,如結(jié)扎、壓迫止血法僅適合大血管出血,對彌漫性出血控制困難;藥物止血僅能作為輔助手段止血,對內(nèi)臟大出血的直接止血作用有限;此外,止血后殘留在人體腔道內(nèi)的血液容易引起組織粘連等。因此,新型的可吸收的止血材料是止血領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)?,F(xiàn)國內(nèi)臨床上用于醫(yī)用止血材料主要有纖維蛋白膠、明膠海綿、氧化纖維素、微纖維膠原、醫(yī)用生物蛋白膠及藻酸鈣纖維等[2],雖然具備一定的止血效果,但也存在著粘附性一般,容易脫落,用于實(shí)質(zhì)性器官大面積創(chuàng)面止血容易被血液沖脫而產(chǎn)生二次出血的風(fēng)險。纖維蛋白貼是我國自行研發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生物制品5類新藥,是一種新型的止血材料,主要由纖維蛋白原、凝血酶、膠原蛋白、核黃素等材料和蛋白骨架組成。其止血作用目前尚未見相關(guān)報道,本課題旨在研究纖維蛋白貼的止血作用,并與臨床上已經(jīng)上市銷售的醫(yī)用生物蛋白膠進(jìn)行比較,為止血新材料的止血研發(fā)提供參考依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 動物 SD大鼠,SPF級,♀♂兼用,180~200 g,90只,從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購入。西藏小型豬,普通級,♀♂兼用,8~10 kg,6只,廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)動物研究開發(fā)中心提供。
1.1.2 試劑 戊巴比妥鈉,中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?;瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品(進(jìn)口分裝),規(guī)格,25 g/瓶,批號F20020915。醫(yī)用生物蛋白膠(悅靈膠):杭州普濟(jì)醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn),批號:20080103,儲存于2℃ ~8℃。
纖維蛋白貼,廣州春榮生物科技有限公司提供,批號:20061210,規(guī)格:(4.8×9.5×0.5)cm,低劑量貼片含藥量為臨床貼片的1/3;使用時先用生理鹽水浸潤,樣品貯存:2℃ ~8℃保存。臨床擬用方案:根據(jù)創(chuàng)面的實(shí)際大小確定,一般要求纖維蛋白貼的覆蓋面邊緣離創(chuàng)面邊緣約1 cm。
1.1.3 儀器與設(shè)備 日本Sysmex CA-510凝血儀;賽多利斯 150FE-L、TE4100-L、BP3100S、BS400SWEI型電子天平。
1.2 方法
1.2.1 劑量設(shè)計與給藥方案 大鼠設(shè)計3個纖維蛋白貼劑量組,分別為:纖維蛋白貼高劑量為將3層臨床貼片重疊,纖維蛋白貼中劑量為使用1張臨床應(yīng)用貼片,纖維蛋白貼低劑量為使用1張低劑量貼片,各劑量組使用時根據(jù)傷口大小進(jìn)行恰當(dāng)裁剪使用。小型豬只設(shè)計1個纖維蛋白貼臨床應(yīng)用貼片組。
1.2.2 SD 大鼠肝創(chuàng)傷面出血試驗(yàn)[3-4]選用 SD大鼠90只,按體重隨機(jī)分成6組,即假手術(shù)組、模型對照組、醫(yī)用生物蛋白膠組、纖維蛋白貼高、中、低劑量組,每組15只。動物先進(jìn)行造模:大鼠戊巴比妥鈉麻醉后,將腹部毛發(fā)剃除,常規(guī)消毒后在腹部劍突下正中開一2~3 cm切口,暴露肝臟,小心將大鼠肝右葉游離出腹腔,并在肝臟下方放置一塊干凈的紗塊(已消毒稱重),然后用手術(shù)剪將大鼠肝右葉部分切除,切除肝臟體積約為(1.6×0.7×0.5)cm。大鼠肝右葉部分切除后立即將預(yù)先準(zhǔn)備好纖維蛋白貼(或噴醫(yī)用生物蛋白膠)貼于切口上,貼上時立即計時,觀察出血時間。貼上纖維蛋白貼(或噴上醫(yī)用生物蛋白膠)時用肝臟下方的紗塊輕輕按壓傷口,使纖維蛋白貼(或醫(yī)用生物蛋白膠)與切口粘牢,并可將切口的滲血吸干,待切口不再出血時稱量紗塊的重量即可計算出血量[出血量(ml)=(止血后紗塊重量-止血前紗塊重量)/血液密度],模型對照組直接用紗塊壓迫止血,待紗布上血印較淡時停止計時,中間時段即為出血時間,若出血時間大于20 min則以20 min計。出血時間及出血量測量完畢后將大鼠腹腔縫合關(guān)閉。假手術(shù)組大鼠打開腹腔后將肝臟暴露后即關(guān)閉腹腔,其它不做任何處理。術(shù)后2天、1周、2周、4周各組動物頸總靜脈采血約1 ml用于檢測給藥后動物凝血功能[5]的變化及腹腔探查腹膜粘連情況。術(shù)后第1周、2周、4周每組分別隨機(jī)抽取5只大鼠處死,小心將其腹腔打開,觀察并記錄大鼠腹腔粘連情況,然后剪取大鼠肝損傷創(chuàng)傷面,中性PBS福爾馬林液固定后病理檢測。
1.2.3 西藏小型豬肝、脾臟創(chuàng)面出血試驗(yàn)[6-7]選用西藏小型豬6只,按體重將隨機(jī)分成3組,即模型組、醫(yī)用生物蛋白膠組、纖維蛋白貼組,每組2只。然后將小型豬麻醉后腹腔打開,游離脾臟及肝臟,使其充分暴露,分別對肝臟和脾臟進(jìn)行創(chuàng)面損傷。損傷標(biāo)準(zhǔn):肝臟做一長約5 cm、寬約2 cm、深約0.5 cm的創(chuàng)面,脾臟做一長約5 cm、寬約2 cm、深約0.5 cm的創(chuàng)面,脾臟和肝臟切開之后,立即進(jìn)行出血時間及出血量測定,方法同“1.2.2”。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計分析,各組計量數(shù)據(jù)均計算±s,組間比較采用ANOVA法統(tǒng)計分析。各計量數(shù)據(jù)則進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。
2.1 對SD大鼠肝創(chuàng)傷面出血的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明(Tab 1-3):①纖維蛋白貼高、中、低劑量組均能有效的減少大鼠肝創(chuàng)傷面的出血量及縮短出血時間(P<0.01),高、中、低劑量組在減少大鼠肝創(chuàng)傷面出血量方面組間差異,但實(shí)驗(yàn)過程中能觀察到肝創(chuàng)傷面血液剛好能透過低劑量的纖維支架,而不能透過高、中劑量組的纖維支架。在出血時間上,纖維蛋白貼高劑量組出血時間少于中、低劑量組。醫(yī)用生物蛋白膠組也能明顯減少出血量及縮短出血時間(P<0.01),試驗(yàn)過程還觀察到纖維蛋白貼與創(chuàng)傷面結(jié)合緊密,不易分離,而醫(yī)用生物蛋白膠與傷口結(jié)合疏松,很容易脫落導(dǎo)致重新出血。②術(shù)后2 d及給藥后1周、2周、4周,與模型組、假手術(shù)組相比,纖維蛋白貼高、中、低劑量組 PT、APTT、TT、Fbg 均未見明顯差別(P>0.05)。③對大鼠腹腔臟器粘連的影響:術(shù)后48 h,除假手術(shù)組無粘連外,其余各試驗(yàn)組大鼠肝創(chuàng)面均與周邊組織發(fā)生粘連。模型組、醫(yī)用生物蛋白膠組、纖維蛋白貼組給藥后1、2周開腹探查及4周后動物末次處理時仍與周邊組織有粘連,但模型組肝創(chuàng)面和藥物及周邊組織粘連緊密,難以分開,纖維蛋白貼各組大鼠肝創(chuàng)面與周邊組織粘連較疏松,而醫(yī)用生物蛋白膠組與周邊組織粘連程度介于兩者之間。④大鼠肝創(chuàng)傷面病理切片結(jié)果可見:纖維蛋白貼各劑量組與醫(yī)用生物蛋白膠組大鼠均未見引起接觸組織病理性的組織學(xué)改變,創(chuàng)面恢復(fù)良好,具體見Fig 1~22。
Tab 1 Amount of bleeding and bleeding time of SD rats’liver affected by Fibrin Patch(±s,n=15)
Tab 1 Amount of bleeding and bleeding time of SD rats’liver affected by Fibrin Patch(±s,n=15)
**P<0.01 vs model group
Group Dose Amount of bleeding/ml Bleeding time/s Sham - 0 0 Model - 0.54±0.37 644±238 Fibrin glue 1.0 ml 0.17 ±0.13** 156±71**Fibrin Patch high dose 3 pieces 0.15 ±0.14** 70±37**Fibrin Patch medium dose 1 piece 0.19 ±0.27** 139±174**Fibrin Patch low dose 1/3 piece 0.15 ±0.20** 202±142**
2.2 對西藏小型豬肝、脾創(chuàng)面出血的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明(Tab 5):①與模型組相比,纖維蛋白貼組能明顯減少西藏小型豬肝損傷面的出血量,也能縮短止血時間。醫(yī)用生物蛋白膠組也能減少小型豬肝損傷面的出血量和出血時間。②與模型組相比,纖維蛋白貼組能明顯減少小型豬脾的出血量,也能縮短脾的出血時間。醫(yī)用生物蛋白膠組也能明顯減少小型豬脾臟的出血量及縮短出血時間。③與醫(yī)用生物蛋白膠組相比,纖維蛋白貼組對肝、脾損傷面的出血量和出血時間相近,但試驗(yàn)過程中能明顯觀察到醫(yī)用生物蛋白膠與肝、脾損傷面結(jié)合不緊密,非常疏松,容易被創(chuàng)傷面血液的壓力沖開或分離,且可見創(chuàng)傷面的血液是從膠體邊緣漏出的,這可能在一定的程度上影響了膠體對創(chuàng)傷面之間的粘度;而纖維蛋白貼與肝、脾創(chuàng)傷面結(jié)合非常緊密,不易脫落,血液是透過其支架滲出的。
Tab 2Blood clotting of SD rats affected by Fibrin Patch(±s)
Tab 2Blood clotting of SD rats affected by Fibrin Patch(±s)
Group PT/s APTT/s d 2 wk 1 wk 2 wk 4 Sham 12.3 ±2.4 11.9 ±0.9 11.8 ±2.9 11.8 ±1.0 20 ±d 2 wk 1 wk 2 wk 4 5 17±2 16±6 15±1 Model 11.3 ±4.5 10.5 ±0.7 11.5 ±2.6 12.0 ±1.0 20 ±4 16 ±2 15 ±4 14 ±3 Fibrin glue 11.1 ±1.3 10.9 ±0.9 12.3 ±1.8 11.8 ±1.2 17 ±3 18 ±6 16 ±4 15 ±2 Fibrin Patch high dose 12.1 ±2.6 11.6 ±1.1 11.2 ±1.2 11.1 ±1.4 18 ±6 16 ±3 15 ±3 14 ±1 Fibrin Patch medium dose 12.4 ±2.5 11.5 ±0.6 11.2 ±1.4 10.2 ±1.3 19 ±7 16 ±3 16 ±3 15 ±2 Fibrin Patch low dose 11.3 ±2.4 11.9 ±1.3 11.5 ±0.6 11.9 ±1.8 19 ±5 15 ±1 16 ±2 15 ±3
Tab 3Blood clotting of SD rats affected by Fibrin Patch(±s)
Tab 3Blood clotting of SD rats affected by Fibrin Patch(±s)
-1 Group TT/s Fbg/g·L d 2 wk 1 wk 2 wk 4 Sham 43 ±10 39 ±2 40 ±1 41 ±4 3.5 ±0.4 2.8 ±0.3 2.6 ±d 2 wk 1 wk 2 wk 4 0.9 2.0 ±0.4 Model 39 ±7 42 ±5 43 ±3 43 ±1 3.4 ±0.4 2.9 ±0.4 2.2 ±0.8 1.9 ±0.2 Fibrin glue 43 ±6 37 ±6 44 ±2 41 ±2 3.5 ±0.4 2.8 ±0.5 2.3 ±0.3 1.9 ±0.1 Fibrin Patch high dose 40 ±7 44 ±5 43 ±3 40 ±2 3.2 ±0.5 2.8 ±0.4 2.4 ±0.7 1.9 ±0.3 Fibrin Patch medium dose 40 ±8 41 ±8 42 ±3 40 ±2 3.5 ±0.4 2.6 ±0.7 2.5 ±0.6 2.0 ±0.3 Fibrin Patch low dose 38±6 39±7 44±5 41±3 3.1±0.4 2.8 ±0.7 2.4 ±0.7 1.9 ±0.4
Fig 1-12 Wound surface of SD rats’liver affected by Fibrin Patch
Tab 4 Amount of bleeding and bleeding time of miniature pigs’liver and spleen affected by Fibrin Patch(±s)
Tab 4 Amount of bleeding and bleeding time of miniature pigs’liver and spleen affected by Fibrin Patch(±s)
*P<0.05,**P<0.01 vs model group
Group n Dose Wound of liver Amount of bleeding(ml)Bleeding time(s)Wound of spleen Amount of bleeding(ml)Bleeding time(s)Model 2 - 4.2±0.7 748±152 46.5±4.1 1200±0 Fibrin glue 2 2-3 ml 2.8±1.0 575±289 8.6±1.1* 561±19**Fibrin Patch dose 2 1 piece 0.7±0.1* 303 ±78 9.2±0.1*649±251
纖維蛋白貼主要由纖維蛋白原、凝血酶、膠原蛋白、核黃素等組成,即在膠原蛋白形成的膠原海綿基礎(chǔ)上通過特殊技術(shù)方法加入了纖維蛋白原、凝血酶、核黃素等,臨床擬開發(fā)為內(nèi)臟破裂出血、組織滲血等出血病癥的止血材料。膠原蛋白形成的膠原海綿已有報道[8]具有較好的創(chuàng)面止血作用,其吸附在出血創(chuàng)面,形成一層屏障,能有效地阻擋出血并吸附血小板,誘導(dǎo)血小板激活發(fā)生聚集,形成血小板聚集物,從而啟動一期生理止血機(jī)制;纖維蛋白原[9]為凝血因子Ⅰ,凝血酶為活化的凝血因子Ⅱ,常作為藥物用于局部止血,凝血酶能夠促進(jìn)纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白,纖維蛋白形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)包裹血細(xì)胞形成血凝塊或微血栓,堵塞出血血管或創(chuàng)傷表面,形成障礙物,可有效地阻止損傷血管繼續(xù)出血,從而減少出血對膠原海綿層的沖力,保證了膠原海綿在創(chuàng)傷表面粘附更為緊密;同時,凝血酶能激活凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅺ、ⅩⅢ和血小板[10],從而正反饋加速凝血。核黃素即維生素B2,具有促進(jìn)細(xì)胞的再生作用,能誘導(dǎo)創(chuàng)面細(xì)胞再生,加速創(chuàng)面?zhèn)诘挠吓c恢復(fù)。
為考察纖維蛋白貼在不同物種間,對不同臟器、不同出血情況的止血效果,本研究選用大鼠肝出血模型、小型豬肝脾出血模型進(jìn)行研究。在大鼠肝臟出血實(shí)驗(yàn)中,纖維蛋白貼各劑量及醫(yī)用生物蛋白膠均能明顯降低大鼠肝創(chuàng)面出血量,縮短出血時間;其中在出血量方面各給藥組未見明顯差異,而在出血時間方面,纖維蛋白貼中、高劑量優(yōu)于醫(yī)用生物蛋白膠。分析各實(shí)驗(yàn)組出血量差別不明顯的原因在于大鼠肝臟較小,創(chuàng)傷面出血量、出血壓力均較小,而各止血材料均具有一定的止血作用,因此,在出血量方面纖維蛋白貼各劑量組和醫(yī)用生物蛋白膠組均未見明顯差別。在小型豬肝脾創(chuàng)面出血實(shí)驗(yàn)中,纖維蛋白貼對脾臟的止血效果與醫(yī)用生物蛋白膠相當(dāng),而對肝臟的止血效果上,無論是出血量或出血時間均明顯優(yōu)于醫(yī)用生物蛋白膠。且在上述兩實(shí)驗(yàn)中纖維蛋白貼與肝、脾創(chuàng)傷面結(jié)合非常緊密,其形成的膠原海綿纖維支架,能夠承受住出血部位的壓力,不易脫落,從而可避免了產(chǎn)生二次出血的風(fēng)險;對于出血量較多而血液透過其支架滲出的情況,可多層纖維蛋白貼重疊使用進(jìn)行止血,以達(dá)到滿意的止血效果。提示纖維蛋白貼能夠完全包裹住出血創(chuàng)面,既能夠解決創(chuàng)面大出血又能夠控制后續(xù)彌漫性出血情況。醫(yī)用生物蛋白膠作為現(xiàn)在臨床上最常用的醫(yī)藥材料之一,是根據(jù)血液的凝固機(jī)制研制而成的藥物,通過噴涂在創(chuàng)面后即可形成一層纖維蛋白凝膠,粘附在創(chuàng)面上而達(dá)到止血作用,同時其所形成的凝膠具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和粘合力,能減少傷口張力并促進(jìn)愈合,但容易與其它組織的粘連等副作用[11]。本研究中觀察到醫(yī)用生物蛋白膠與肝、脾等創(chuàng)面結(jié)合不緊密,疏松,容易被創(chuàng)傷面血液的壓力沖開或分離,具有引起二次出血的風(fēng)險,且可見創(chuàng)傷面的血液是從膠體邊緣漏出的,這在一定的程度上影響了膠體對創(chuàng)傷面之間的粘度,也是膠體容易脫落的原因(見Fig 17、22)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,纖維蛋白貼各劑量組實(shí)驗(yàn)動物全身凝血功能與同期假手術(shù)組相比未見明顯改變,表明纖維蛋白貼只對出血局部的凝血功能產(chǎn)生作用,未引起全身性的凝血抗凝平衡的改變。纖維蛋白貼組肝創(chuàng)面模型大鼠術(shù)后4周時創(chuàng)面恢復(fù)良好,對機(jī)體未見病理性的組織學(xué)損傷,與周邊組織粘連較疏松,在組織粘連方面優(yōu)于醫(yī)用生物蛋白膠,可能為纖維蛋白貼能夠有效止血,減少血液進(jìn)入腹腔,同時膠原海綿纖維支架作為一層生物膜,能有效阻止周圍結(jié)締組織直接與創(chuàng)面接觸,從而達(dá)到預(yù)防和減少組織粘連的作用,而核黃素促進(jìn)了肝創(chuàng)面細(xì)胞再生,從而有效促進(jìn)肝創(chuàng)面的愈合。此外,纖維蛋白貼還具有使用方便簡單等優(yōu)點(diǎn),臨用時用生理鹽水浸泡后或直接張貼于創(chuàng)傷面即可,對于野外危險作業(yè)和軍事戰(zhàn)爭具有良好的保障。
Fig 13-22 Amount of bleeding of miniature pigs’liver and spleen affected by Fibrin Patch
綜上所述,纖維蛋白貼具有良好的止血作用,對大鼠和小型豬臟器破損出血模型具有良好的止血作用,且可預(yù)防二次出血及減少組織粘連,止血作用強(qiáng)大但不影響機(jī)體全身的凝血功能,其總體效果優(yōu)于醫(yī)用生物蛋白膠。是一種新型的非常理想的創(chuàng)面局部止血材料,具有巨大的應(yīng)用價值、社會效益及軍事戰(zhàn)備意義,值得進(jìn)一步研究開發(fā)。
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