孟 巖，李 艷，葉尚尚，張 月

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，山東青島 266001)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病非常嚴(yán)重的并發(fā)癥，屬致盲性眼病，對(duì)患者的生活質(zhì)量有重大危害。以往認(rèn)為高血糖引發(fā)的視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙是DR的主要損傷因素，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡是DR早期的重要表現(xiàn)。視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞是一種特殊的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，也是視網(wǎng)膜內(nèi)最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，該細(xì)胞是從外界膜延伸到內(nèi)界膜，貫穿于整個(gè)視網(wǎng)膜，能維持視網(wǎng)膜的正常代謝，調(diào)節(jié)神經(jīng)成分和血管成分之間相互作用;在病理狀態(tài)下，其異常活化與許多視網(wǎng)膜變性、缺血性疾病有著密切關(guān)系［1－2］。隨著對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在DR早期視網(wǎng)膜血管病變之前Müller細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能就已經(jīng)發(fā)生了變化［3］。重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)是與天然EPO具有相同生物學(xué)活性的糖蛋白，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其可以通過(guò)血－腦屏障和血－視網(wǎng)膜屏障，參與中樞神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧損傷的保護(hù)，具有廣泛的抗凋亡作用。

由于視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞在維持視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和

功能上的重要性，本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立體外高濃度葡萄糖狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞模型，采用TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)水平，并給予rhEPO干預(yù)，通過(guò)分析各組細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能的改變，來(lái)探討rhEPO對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的保護(hù)作用及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生3～5 d的SD乳鼠5只(符合國(guó)家醫(yī)用動(dòng)物使用標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物合格證號(hào):SLXK魯20080002)，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SD乳鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的培養(yǎng)及純化

用75%酒精浸泡出生3～5 d標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)用SD大鼠處死，轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)，摘取眼球，去除眼前節(jié)及玻璃體，分離視網(wǎng)膜組織。細(xì)胞培養(yǎng)方法同李樹寧等［4］報(bào)道。培養(yǎng)期間，通過(guò)倒置相差顯微鏡，每天觀察培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量、及生長(zhǎng)情況。取第2代細(xì)胞，用抗Müller細(xì)胞特異性谷氨酰胺合成酶抗體，行免疫細(xì)胞化學(xué)染色SP法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。隨機(jī)計(jì)數(shù)每10個(gè)高倍鏡視野(×200)下，胞膜完整的陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性染色Müller細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)。每次計(jì)數(shù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 高糖模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞傳3代時(shí)接種于24孔板并進(jìn)行高糖模型分組，葡萄糖濃度取 25 mmol·L－1:Ⅰ組:空白對(duì)照組(Control)，空白對(duì)照組不給予干預(yù);Ⅱ組:高糖培養(yǎng)組(HG，high glucose);Ⅲ組:高糖+5 kU·L－1rhEPO組(HG+5 kU·L－1rhEPO);Ⅳ組:高糖 +10 kU·L－1rhEPO組(HG+10 kU·L－1rhEPO);Ⅴ組:高糖 +20 kU·L－1rhEPO 組(HG+20 kU·L－1rhEPO);Ⅳ組:高糖+40 kU·L－1rhEPO 組(HG+40 kU·L－1rhEPO)。1.2.3 原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 6組細(xì)胞同時(shí)終止培養(yǎng)。培養(yǎng)液沖洗后加50 μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育 60 min，0.01 mol·L－1的PBS洗滌3次后，使用激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450－500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515-565 nm(綠色熒光)，在熒光顯微鏡下觀察并照相。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù):每組3孔，每孔連續(xù)觀察10個(gè)視野(×200)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，求平均數(shù)。

1.2.4 ELISA方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2和Bax的表達(dá) 分組后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(50 mmol·L－1Tris-Cl，200 mmol·L－1NaCl，2 mmol·L－1EDTA，1%SDS，0.1 mmol·L－1PMSF)，低溫勻漿，離心收集上清液，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔及空白孔，采用雙抗體一步夾心法，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定各孔A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 11.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，多組資料均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定 剛接種的細(xì)胞呈球形或卵圓形，懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)。24 h后細(xì)胞基本貼壁，伸出短小突起。48 h后細(xì)胞體積增大，突起變長(zhǎng)，發(fā)出分支。3～6 d時(shí)，細(xì)胞增多并增大，細(xì)胞突起明顯。1～2周時(shí)，貼壁細(xì)胞達(dá)到80%融合。經(jīng)反復(fù)胰蛋白酶消化，絕大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)較一致，胞體狹長(zhǎng)，胞質(zhì)豐富，核呈圓形或卵圓形。GS免疫細(xì)胞化學(xué)法示陽(yáng)性細(xì)胞胞核呈棕黃色，在光鏡下，每10個(gè)高倍鏡(×200)視野下，細(xì)胞總數(shù)平均為(566±3)個(gè)，陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)平均為(539±5)個(gè)，陽(yáng)性率為95.2%，表明2次傳代的細(xì)胞絕大部分已是純化的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞。

2.2 TUNEL法檢測(cè)Müller細(xì)胞凋亡 空白對(duì)照組僅見(jiàn)極少量陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(Fig 1A)，高糖組同空白組相比凋亡細(xì)胞明顯增多(P＜0.05)(Fig 1B)。而各rhEPO干預(yù)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞同高糖組相比明顯減少(P＜0.05)。見(jiàn)Fig 1C～F，F(xiàn)ig 2。

Fig 1 A few TUNEL positive cells in the retinal Müller cells

Fig 2 Apoptotic cells of different groups

2.3 Bcl-2及 Bax蛋白表達(dá) 空白對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)都較少，高糖組Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯降低，而Bax蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。rhEPO各劑量組Bcl-2蛋白的表達(dá)比高濃度葡萄糖培養(yǎng)組高，Bax蛋白的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Tab 1，2)

Tab 1Expression of Bcl-2 in different groups(±s，n=4)

Tab 1Expression of Bcl-2 in different groups(±s，n=4)

△P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs HG

Group Bcl-2(average absorbance)q P Control 101.98 ±3.56 － －HG 56.08 ±5.12△ 17.99△ ＜0.01△HG+5 kU·L－1rhEPO 67.47 ±4.73# 4.47# ＜0.05#HG+10 kU·L－1rhEP 76.32 ±7.21# 7.94# ＜0.01#HG+20 kU·L－1rhEPO 85，43 ±3.11# 11.51# ＜0.01#HG+40 kU·L－1rhEPO 90.72 ±5.76# 13.58# ＜0.01#

Tab 2Expression of Bax in different groups(±s，n=4)

Tab 2Expression of Bax in different groups(±s，n=4)

△P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs HG

Group Bax(average absorbance)q P Control 3.98 ±0.35 － －HG 5.92 ±0.21△ 13.02△ ＜0.01△HG+5 kU·L－1rhEPO 5.31 ±0.15# 4.09# ＜0.05#HG+10 kU·L－1rhEP 5.06 ±0.32# 5.77# ＜0.05#HG+20 kU·L－1rhEPO 4.72 ±0.27# 8.05# ＜0.01#HG+40 kU·L－1rhEPO 4.34 ±0.41# 10.61# ＜0.01#

3 討論

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)，先行多聚賴氨酸預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)瓶使Müller細(xì)胞更好貼附于瓶上;視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞較其他細(xì)胞貼壁緊，在細(xì)胞貼壁后，用吸管反復(fù)吹打瓶底，使未貼壁或貼壁不緊的組織塊和細(xì)胞懸浮，從而達(dá)到純化目的［5－7］。另外，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，加入少量0.25%胰蛋白酶反復(fù)多次消化后細(xì)胞形態(tài)基本一致。通過(guò)以上方法獲得高數(shù)量和質(zhì)量的標(biāo)本，在體外建立了穩(wěn)定的Müller細(xì)胞培養(yǎng)體系。

國(guó)內(nèi)報(bào)道在STZ-糖尿病大鼠模型中，糖尿病組與正常對(duì)照組相比，視網(wǎng)膜神經(jīng)層細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)降低而Bax蛋白表達(dá)增多，Bcl-2/Bax比值下降。而使用EPO干預(yù)后的糖尿病組，Bcl-2蛋白表達(dá)增多，同時(shí)Bax蛋白表達(dá)又明顯降低，Bcl-2/Bax比值升高［8－10］。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，外源性EPO對(duì)腦缺血、自身免疫性脊髓炎、脊髓束或外周神經(jīng)損傷等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有保護(hù)作用［11－12］。視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的延續(xù)，EPO 同樣參與了缺血性視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的保護(hù)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均有證明，EPO可以促進(jìn)血管生成，通過(guò)增加血供來(lái)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。另外，EPO還能減輕缺血過(guò)程中的炎癥反應(yīng)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。更重要的是，有研究證明 EPO可以通過(guò)酪氨酸蛋白激酶(PTK-2)，激活級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，防止神經(jīng)組織的細(xì)胞凋亡。與天然分離的EPO相比，重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)具有相同氨基酸排列序列，且在體內(nèi)、外生物學(xué)活性基本一致。這些研究表明，EPO可能通過(guò)控制抗凋亡Bcl-2和促凋亡基因Bax的平衡來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本文通過(guò)體外培養(yǎng)SD乳鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)方面，考察rhEPO對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞高濃度葡萄糖損傷的保護(hù)作用。研究結(jié)果表明，空白對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Bcl-2、Bax表達(dá)都較少，高糖組同空白組相比凋亡細(xì)胞增多，且Bcl-2蛋白的表達(dá)降低、Bax蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，與空白對(duì)照組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。各 rhEPO干預(yù)組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞同高糖組相比明顯減少，Bcl-2蛋白表達(dá)比高糖組高，Bax蛋白的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。因此我們推測(cè)，rhEPO對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以抑制細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與增強(qiáng)Bcl-2蛋白的表達(dá)，而降低Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)，為rhEPO用于臨床治療糖尿病早期視網(wǎng)膜損傷提供了一定理論依據(jù)。

目前臨床醫(yī)師對(duì)DR的治療大多只注意其后期發(fā)生的增殖性改變，針對(duì)早期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡尚無(wú)明確有效的治療藥物，隨著科研人員相關(guān)研究的進(jìn)步，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明以rhEPO為代表的抗凋亡制劑未來(lái)將在臨床應(yīng)用中發(fā)揮更加重要的作用。

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