黃瑩瑩，劉 浩，李 陽，浦龍健，張旭東，蔣志文，蔣琛琛

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽蚌埠 233000;

2.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233000)

近年來，我國惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的重大疾病。鼻咽癌是我國南方最常見的惡性腫瘤之一，目前，放療和順鉑輔助化療在臨床已經(jīng)作為鼻咽癌治療的標(biāo)準(zhǔn)療法。然而，治療后病人的5年生存率只有50%左右，其主要原因就是鼻咽癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物以及放療敏感性的降低［1］。因此，研究其耐藥機(jī)制、克服化療耐藥，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一［2］。本研究以人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2為研究對(duì)象，觀察了糖基化抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose，2-DG)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，聯(lián)合腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體(tumors necrosis factor-related apotosis-inducing ligand，TRAIL)，檢測(cè)2-DG增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用，并初步對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討，以期為鼻咽癌的臨床治療提供新的思路和方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE-2購于中科院上海細(xì)胞庫，蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理研究室凍存培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Hepes、新生牛血清:Gibco公司。2-DG:Sigma公司。兔抗人GRP78抗體，鼠抗人 β-actin:Santa Cruz公司。兔抗人Caspase-3抗體:Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞CNE-2采用DMEM高糖培養(yǎng)液，含 10%滅活 FCS，2.0 g·L－1Hepes，2.0 g·L－1碳酸氫鈉，1 ×105IU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加100 μl含7×103個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24 h之后，棄去每孔培養(yǎng)液，換新鮮含10%新生牛血清培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)設(shè)調(diào)零組、對(duì)照組和不同濃度藥物處理組，藥物濃度為 0.625、1.25、2.5、5、10 mmol·L－12-DG以及200 μg·L－1TRAIL與不同濃度2-DG合用組。終止培養(yǎng)前4 h，每孔加 MTT 10 μl(5 g·L－1)，加藥后24～72 h(藥物作用終點(diǎn)時(shí)間)終止培養(yǎng)，棄去上清液，加入二甲基亞砜200 μl每孔，37℃孵育15 min，全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的570 nm波長(zhǎng)吸光度A值，各藥重復(fù)實(shí)驗(yàn)3組。

1.2.3 溴化丙啶(propidium iodide，PI)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞至10 ml離心管，1 500 r·min－1，離心 5 ～ 10 min，去上清，加入體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇4℃固定過夜。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至5 ml離心管1 500 r·min－1，離心5～10 min，去上清，用 PBS洗滌，離心1 500 r·min－1，5 ～10 min，去上清，每管加入 600 μl PI緩沖液(5 mg PI、0.1 g 檸檬酸鈉、100 μl Triton X-100、100 ml dH2O)，避光保存3～4 h，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。利用PI染色，檢測(cè)具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液(總體積200 ml:100 mmol·L－1Tris-HCL pH 7.4 20 ml、1 mol·L－1NaCl 28 ml、100 mmol·L－1CaCl21 ml、100 mmol·L－1MgCl221 ml、15 mmol·L－1NaN340 ml、Triton X-100 2 ml、用前加人蛋白酶抑制劑 12 μmol·L－1Leupeptin、1 mmol·L－1PMSF 各2 ml·L－1)冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法(參照試劑盒說明書操作)測(cè)各組蛋白濃度，用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min變性。每組取蛋白 30 μg，10%和15%SDSPAGE 凝膠電泳(70 V，30 min;90 V，90 min);轉(zhuǎn)膜以恒流250 mA，轉(zhuǎn)移2～3 h至PVDF膜;5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4℃過夜);PBS洗凈牛奶;一抗:1∶1 000，室溫孵育2 h(或4℃過夜);TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次;二抗:1∶2 000，室溫孵育2 h;TPBS洗滌3次，PBS洗滌1次;ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像、測(cè)量灰度值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 集落克隆實(shí)驗(yàn) 用含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度后，分別以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后加0.1 mmol·L－12-DG，4 μg·L－1TRAIL以及兩者合用處理鼻咽癌細(xì)胞，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～9 d，觀察到細(xì)胞集落形成后，去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍，4% 多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色。

2 結(jié)果

2.12 -DG增強(qiáng)TRAIL對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的增殖抑制作用 為觀察2-DG對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的增殖抑制作用以及對(duì)TRAIL抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖作用的影響，實(shí)驗(yàn)中使用不同濃度的2-DG處理鼻咽癌細(xì)胞，并聯(lián)合TRAIL，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，5 mmol·L－12-DG作用于鼻咽癌細(xì)胞 CNE-2的 24、48、72 h存活率分別為76.96%、70.83%、69.39%。TRAIL作用于鼻咽癌細(xì)胞 CNE-2的 24、48、72 h的存活率分別為56.08%、42.93%、30.86%。而聯(lián)合 200 μg·L－1TRAIL作用于鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的24 h的存活率為15.44%。TRAIL、2-DG與2-DG誘導(dǎo) TRAIL抑制鼻咽癌細(xì)胞存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見 Fig 1。

Fig 1 Effects on the viability of human nasopharyngeal carcinoma CNE-2

2.2 2-DG增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2凋亡的作用 實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同因素處理的細(xì)胞進(jìn)行PI染色，并通過流式細(xì)胞儀分析，觀察藥物誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)果見Fig 2。5 mmol·L－12-DG作用于鼻咽癌細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的凋亡率為7.7%(Fig 2B)，與陰性對(duì)照組2.9%比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，F(xiàn)ig 2A)。200 μg·L－1TRAIL 誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞 CNE-2 24 h 的凋亡率為40.7%(Fig 2C)。5 mmol·L－12-DG與200 μg·L－1TRAIL合用誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2 24 h的凋亡率為78.9%(Fig 2D)，與2A及2B比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，2-DG本身并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但可以增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

Fig 2 TRAIL-induced CNE-2 apoptosis increased by 2-DG

2.32 -DG增強(qiáng)TRAIL對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的集落克隆形成的抑制作用 為進(jìn)一步觀察2-DG抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的增殖作用以及對(duì)TRAIL抑制鼻咽癌細(xì)胞CNE-2增殖作用的影響，實(shí)驗(yàn)中使用0.1 mmol·L－12-DG 刺激細(xì)胞，并聯(lián)合 4 μg·L－1TRAIL，使用集落克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2增殖作用的影響。Fig 3中，A、B、C、D分別是空白對(duì)照組、0.1 mmol·L－12-DG、4 μg·L－1TRAIL 和 0.1 mmol·L－12-DG+4 μg·L－1TRAIL處理CNE-2細(xì)胞，給藥處理7 d后，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色。結(jié)果表明，2-DG在低濃度即可明顯抑制CNE-2細(xì)胞集落克隆的形成，并可增強(qiáng)TRAIL的抑制作用。

Fig 3 2-DG increases the colony formation inhibiting effect of TRAIL on CNE-2 cells

2.42 -DG對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的CNE-2的GRP-78及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 CNE-2給予不同的刺激后收集蛋白，Western blot檢測(cè) GRP-78以及Caspase-3蛋白的表達(dá)，從Fig 4可以看出，2-DG可以誘導(dǎo)GRP-78的表達(dá)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，GRP-78的表達(dá)不斷增強(qiáng)。2-DG本身并不誘導(dǎo)Caspase-3的激活，TRAIL可以誘導(dǎo)一定的Caspase-3的激活，二者聯(lián)用后，Caspase-3的激活明顯增加。

3 討論

鼻咽癌是我國南方地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，以化療為主的綜合治療作為鼻咽癌治療的有效手段，一直在臨床中占據(jù)著重要的地位［3］。

Fig 4 Expressions of GRP-78 and Caspase-3 in CNE-2 cells.

己糖激酶抑制劑2-DG是一種葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，它可以抑制糖酵解途徑、糖基化和細(xì)胞增殖，并且它還是一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的經(jīng)典誘導(dǎo)劑［4］。腫瘤細(xì)胞在發(fā)生時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)迅速，新生血管的生長(zhǎng)滯后于腫瘤的生長(zhǎng)，因此，血管提供營養(yǎng)和氧氣的能力無法滿足腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，此時(shí)，糖酵解途徑就不可避免的增加了。腫瘤細(xì)胞對(duì)糖酵解通路產(chǎn)能依賴增強(qiáng)的現(xiàn)象，我們稱之為瓦博格效應(yīng)［5－6］。2-DG作為葡萄糖的結(jié)構(gòu)類似物，它能夠競(jìng)爭(zhēng)性的抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，從而切斷腫瘤細(xì)胞的能量來源，降低 ATP 的產(chǎn)生，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)［7－8］。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP-78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)功能的中心調(diào)節(jié)者，由于其在蛋白質(zhì)折疊、聚集、促進(jìn)非折疊蛋白降解、ER Ca2+連接和控制ER跨膜感受器的激活等過程中具有重要作用，因此GRP-78的誘導(dǎo)被廣泛用作 ER應(yīng)激和 UPR啟動(dòng)的生物標(biāo)記［9－10］。體外研究顯示，腫瘤細(xì)胞程序性的合成GRP-78維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，構(gòu)筑自身防御機(jī)制。在生長(zhǎng)環(huán)境惡劣的腫瘤微環(huán)境中，鼻咽癌細(xì)胞自身發(fā)生ER應(yīng)激激活UPR［11］。但必須強(qiáng)調(diào)的是，UPR本身是一種細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，但過度的UPR最終啟動(dòng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程［12］。但長(zhǎng)期臨床應(yīng)用顯示2-DG對(duì)腫瘤的治療效果不佳，且存在一定的不良反應(yīng)，因此，尋找一種藥物與2-DG聯(lián)用以達(dá)到良好的治療效果一直是臨床研究的熱點(diǎn)。本次研究觀察了2-DG增強(qiáng)TRAIL抗鼻咽癌的作用。從上述結(jié)果可以看出，2-DG可增強(qiáng)TRAIL對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的增殖抑制作用，增強(qiáng)其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;2-DG還可以增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的GRP-78表達(dá)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并增強(qiáng)Caspase-3蛋白的激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

TRAIL是腫瘤壞死因子超家族中的一員，具有強(qiáng)大的和特異性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，并且對(duì)正常細(xì)胞無此效應(yīng)。TRAIL通過與細(xì)胞膜上的死亡受體結(jié)合而激活凋亡信號(hào)途徑［13］。死亡受體DR4或DR5與TRAIL結(jié)合后，形成配體－受體三聚復(fù)合物，誘導(dǎo)死亡受體胞質(zhì)段死亡結(jié)構(gòu)域(DD)與Fas相關(guān)蛋白的死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)C端DD結(jié)合。FADD以其N端死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)與proceaspase-8結(jié)合，形成DR4/DR5-FADD-procaspase-8死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)，促使其中procaspase-8自身催化成有活性的Caspase-8。Caspase-8活化后，通過兩條信號(hào)途徑傳遞凋亡信號(hào)［14］。一型細(xì)胞通過線粒體非依賴型途徑，即活化的Caspase-8直接激活下游效應(yīng)蛋白Caspase-3、Caspase-6或Caspase-7而誘導(dǎo)凋亡。二型細(xì)胞通過線粒體依賴型途徑傳遞凋亡信號(hào)，即活化的Caspase-8催化Bc1-2家族蛋白Bid斷裂形成截短的Bid(tBid)，tBid定位于線粒體膜，引起線粒體跨膜電位降低或破壞，促使線粒體釋放細(xì)胞色素 C(cyt C)和 Smac，cyt C、Apaf-1和dATP共同促使procaspase-9自身催化形成有活性的Caspase-9，進(jìn)而活化效應(yīng)蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15－16］。

2-DG已被廣泛研究作為一種可能的靶向治療劑來治療腫瘤，或者用來增強(qiáng)其他抗腫瘤藥物的治療效果［17－18］。鼻咽癌和其他腫瘤細(xì)胞一樣，都依賴于增加葡萄糖攝取，以維持細(xì)胞的生長(zhǎng)。2-DG能否提高臨床腫瘤治療效果的研究也在不斷深入，例如2-DG具有協(xié)同放射治療增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞死亡的作用［19］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了2-DG對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，在聯(lián)合TRAIL作用時(shí)，證明了其增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的作用。

總之，本研究證實(shí)了糖基化抑制劑2-DG對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，但其本身并不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但可明顯增加TRAIL誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞的凋亡。其機(jī)制可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)Caspase-3激活而發(fā)揮作用。本研究為糖基化抑制劑的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為增強(qiáng)臨床常用化療藥物提供了一個(gè)良好的策略。

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