何振輝，何太平，翁閃凡，黃越群，梁念慈

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗系，廣東佛山 528000;2廣東醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東 湛江 524023;3.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東湛江 524023)

蘆薈大黃素(Aloe emodin，AE)是蘆薈和大黃的有效成分，化學(xué)名稱為1，8-二羥基-3-羥甲基蒽醌。分子式為C15H10O5，分子質(zhì)量270.23，結(jié)構(gòu)式見參考文獻(xiàn)［1］。AE具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物學(xué)活性和藥理作用。AE能抑制白血病細(xì)胞HL-60的生長，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞、人舌鱗癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，其機制涉及PKC的激活及 caspase的活化［2－3］。但 AE對人源性腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的報道較少 ，AE對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響，未見文獻(xiàn)報道。該文研究了AE對人高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231體外侵襲、運動等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)能力的影響并分析了其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞株 人高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清，1×105U·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)過消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.1.2 主要試劑和藥品 小牛血清購自杭州四季青公司;MTT購自Amresco公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;PVPF 濾膜(孔徑 8 μm，直徑 13 mm)購自 Osmonics公司;Fibronectin、Matrigel購自 BD公司;FAK兔IgG多抗購自Cell Signal公司，使用時以TBST溶液按1∶2 000稀釋;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自美國PTGLAB公司，使用時以TBST溶液按1∶4 000稀釋。蘆薈大黃素、明膠購自Sigma-Aldrich公司，實驗前AE以DMSO溶解，培養(yǎng)液稀釋，DMSO終濃度小于或等于0.1%(V/V)，實驗表明該濃度對細(xì)胞生長無影響。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制試驗 采用MTT法:參照文獻(xiàn)［4］，選取對數(shù)期生長的 MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、臺盼藍(lán)染色后在血細(xì)胞記數(shù)板上記數(shù)，確保細(xì)胞存活率在97%以上。調(diào)整細(xì)胞濃度以(0.5～1)×108·L－1，接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔 100 μl，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下過夜，用藥組加入不同濃度藥物，使 AE 終濃度為 10、20、40、80、160 μmol·L－1，每個濃度設(shè)3～5個平行孔，并設(shè)空白對照組、溶劑對照組和完全培養(yǎng)基調(diào)零孔，置培養(yǎng)板于孵箱中6 h，每孔加入 10 μl MTT(5 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。傾去培養(yǎng)液，應(yīng)用PBS洗板防止MTT殘留，每孔加入200 μl DMSO溶解，于酶標(biāo)儀上測定波長為570 nm處吸光度。實驗重復(fù)3次。據(jù)下面的公式計算出抑制率:

1.2.2 重組基底膜侵襲實驗、趨化性運動能力測定［4－5］將 PVPF濾膜用指甲油 manicure貼在 Transwell小室上，風(fēng)干;在膜的外表面涂Fibronectin 5 μg(10 μl)，置超凈臺內(nèi)風(fēng)干，膜內(nèi)表面涂Matrigel 5 μg(10 μl)，使之干燥，形成人工重組基底膜;在24孔板內(nèi)加入0.1%BSA-DMEM，每孔600 μl;收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，懸浮于0.1%BSADMEM無血清培養(yǎng)基中，使終濃度為1×109·L－1;將Transwell小室浸于24孔板的條件培養(yǎng)基中，將MDA-MB-231細(xì)胞懸液加到Transwell小室中，每小室 100 μl，并同時加入各濃度的 AE 1 μl，對照組加入等量的PBS。37℃、5%CO2溫箱內(nèi)孵育6 h。將Transwell小室取出，濾膜用甲醇固定1 min，蘇木精染色3 min，水洗，伊紅染色10 s，水洗，用生理鹽水浸濕的棉簽擦去濾膜內(nèi)表面的細(xì)胞;用封片膠將濾膜封于載玻片上，于400×顯微鏡下計數(shù)穿過PVPF濾膜的細(xì)胞數(shù)。每膜計數(shù)5個隨機視野，每組平行設(shè)3個濾膜。

趨化性運動能力測定與侵襲試驗相比，只是PVPF濾膜上不需鋪 Matrigel。

1.2.3 real time PCR檢測 mRNA表達(dá)水平 待MDA-MB-231細(xì)胞貼壁生長后，分別加入 PBS、0.1%DMSO 和終濃度為 20、40、80 μmol·L－1AE 處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明配置 PCR反應(yīng)體系，在Mx3000P實時定量熒光PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為:94℃，10 s;53℃，20 s;72℃，15 s。其中，circle1變性5 min;共循環(huán)40次。引物序列如下:FAK sense:5'-ATGTTCTGGTGTCCTCAAATG-3'，antisense:5'-GAGGTAAAACGTCGAAAATTG-3';GAPDH Sense:5'-TCATTG ACCTCAACTACATGGTTT-3'，anti-sense:5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。記錄各管 CT 值，采用2－△△CT法［6］進(jìn)行相對定量。

1.2.4 Western blot分析蛋白表達(dá)水平 待MDAMB-231細(xì)胞貼壁生長后，分別加入PBS、0.1%DMSO 和終濃度為 20、40、80 μmol·L－1AE 處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌后用預(yù)冷的細(xì)胞裂解液刮下，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 ml離心管中，置于碎冰上冰育30 min后，于4℃，12 000×g離心15 min。上清液轉(zhuǎn)移至另預(yù)冷1.5 ml離心管中，取少量上清用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取相同含量蛋白樣品和4×上樣緩沖液以3∶1的比例混合，100℃水中煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。Western blot的方法參照《分子克隆實驗指南》，步驟分別為SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，雜交，顯影，拍照。以β-actin為內(nèi)參照分析目的基因的表達(dá)。

1.2.5 明膠酶譜分析 參照文獻(xiàn)［7］。取對數(shù)期生長的MDA-MB-231細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)。細(xì)胞貼壁生長后，加入含不同濃度 AE的無血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清液，作為測定樣品。制備含0.1%明膠的10%分離膠，5%濃縮膠，進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE。然后剝膠，洗脫SDS，加入明膠酶緩沖液，37℃恒溫?fù)u床中溫浴16 h。考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色，觀察負(fù)染帶。

2 結(jié)果

2.1 AE處理6h對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用 MDA-MB-231細(xì)胞加入不同濃度的AE，分別培養(yǎng)6 h，用MTT法測定藥物對細(xì)胞生長的影響，可見AE對MDA-MB-231細(xì)胞短時增殖的抑制作用很輕微。見Tab 1。

從 Tab 1 中可以看到，20、40、80 μmol·L－1的AE在6 h內(nèi)對MDA-MB-231細(xì)胞生長的抑制率均少于10%，且與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)意義，為了排除藥物對細(xì)胞的毒性作用從而考察AE對MDAMB-231細(xì)胞體外侵襲和趨化性運動能力的影響，故選擇 20、40、80 μmol·L－1作為體外侵襲、趨化性運動的濃度。

Tab 1 Inhibitory effect of AE on proliferation of MDA-MB-231 cells after 6h treatment(±s，n=3)

Tab 1 Inhibitory effect of AE on proliferation of MDA-MB-231 cells after 6h treatment(±s，n=3)

*P ＜0.05 vs control

Concentration/μmol·L－1 Exposure time:6 h A570Inhibitory rate/%15.30 ±4.76 Control 0.612 ±0.019 0.00 ±3.03 0.1DMSO 0.620 ±0.037 －1.31 ±6.01 AE 10 0.602 ±0.027 1.69 ±4.40 20 0.597 ±0.045 2.56 ±7.38 40 0.590 ±0.041 3.59 ±6.67 80 0.562 ±0.030 8.22 ±4.82 160 0.519 ±0.029*

2.2 AE對MDA-MB-231細(xì)胞侵襲重組基底膜能力的影響 20、40、80μmol·L－1的的 AE 作用于MDA-MB-231細(xì)胞6 h后，細(xì)胞體外侵襲人工重組基底膜的能力降低.，其抑制率分別為 (26.13±8.19)%，(38.50±7.10)%，(52.98±5.46)%，見Tab 2，F(xiàn)ig 1A、B。

Tab 2 Effect of AE on the invasive ability of MDA-MB-231 cells(±s，n=3)

Tab 2 Effect of AE on the invasive ability of MDA-MB-231 cells(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs control

Group Concentration/μmol·L－1 Cell count/cells/field Inhibitory rate/%Control 91.60 ±6.74 0.00 ±7.36 0.1%DMSO 90.93 ±6.55 0.73 ±6.55 AE 20 67.67 ±7.51＊＊ 26.13 ±8.19 40 56.33 ±6.51＊＊ 38.50 ±7.10 80 43.07 ±5.00＊＊52.98 ±5.46

2.3 AE對MDA-MB-231細(xì)胞趨化性運動能力的影響 20、40、80 μmol·L－1的 AE 作用于 MDA-MB-231細(xì)胞6 h后，細(xì)胞體外趨化性運動能力明顯降低，其抑制率分別為 (12.65±8.18)%、(34.24±5.20)%、(45.88 ±8.51)%。見 Tab 3，F(xiàn)ig 1 C、D。

2.4 AE對MDA-MB-231細(xì)胞 FAK mRNA、蛋白表達(dá)的影響 不同濃度的AE處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，檢測結(jié)果表明，AE下調(diào)FAK mRNA和蛋白的表達(dá)水平，見Fig 2、3。

2.5 AE對MDA-MB-231細(xì)胞MMP分泌的影響不同濃度的AE處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-9活性明顯降低，表明MMP-9的分泌明顯減少，見Fig 4。

Tab 3 Effect of AE on the migratory ability of MDA-MB-231cells(±s，n=3)

Tab 3 Effect of AE on the migratory ability of MDA-MB-231cells(±s，n=3)

＊＊P ＜0.01 vs control

Group Concentration/μmol·L－1 Cell count/cells/field Inhibitory rate/%Control 105.93 ±7.88 0.00 ±7.43 0.1%DMSO 106.67 ±6.66 －0.79 ±6.29 AE 20 92.53 ±8.66 12.65 ±8.18 40 69.67 ±5.51＊＊ 34.24 ±5.20 80 57.33 ±9.03＊＊45.88 ±8.51

Fig 1 MDA-MB-231 cells attached on PVPF membranes

Fig 2 Effect of AE on the expression of FAK mRNA in MDA-MB-231cells

3 討論

Fig 3 Effect of AE on the expression of FAK protein in MDA-MB-231 cells

Fig 4 Effect of AE on the activity of MMP-9 produced by MDA-MB-231 cells

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的重要原因。盡管化療、放療等技術(shù)的進(jìn)步，但迄今為止，仍沒有抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的有效措施和藥物。本研究首次報道了AE對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231體外轉(zhuǎn)移能力的抑制作用，為抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的研究提供新的思路，并為抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)。

乳腺癌轉(zhuǎn)移是一個多因素參與、多步驟的生物學(xué)過程，此過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)如癌細(xì)胞的侵襲、運動、黏附等均與黏著斑激酶(FAK)有密切的聯(lián)系。FAK是一種非受體酪氨酸激酶(NRPTKs)，參與調(diào)節(jié)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。FAK的關(guān)鍵位點Tyr397磷酸化后，可 通 過 FAK/Src、FAK/PI3K-AKT、FAK/Ras-MAPK等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與乳腺癌細(xì)胞的生存、凋亡、運動及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)分泌［8－9］。FAK 雖然不是經(jīng)典的原癌基因和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的啟動因子，卻具有潛在的癌基因特征。我們的研究表明，AE下調(diào)FAK mRNA和蛋白的表達(dá)水平，這可能是AE抑制MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲、運動等轉(zhuǎn)移相關(guān)潛能的原因。

20世紀(jì)90年代，Liotta等［10］提出癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的三步學(xué)說，其中關(guān)鍵的一步是ECM的降解、基底膜破損、有利于癌細(xì)胞的穿出?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)正是介導(dǎo)這一環(huán)節(jié)的內(nèi)源性蛋白水解酶。MMP-9是MMP家族的一員，其表達(dá)或活性增高與乳腺癌、舌癌等多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移正相關(guān)。文獻(xiàn)報道，在多種腫瘤中FAK與MMP-9的表達(dá)密切相關(guān)。在肝癌細(xì)胞中，F(xiàn)AK的激活使AKT第473位絲氨酸磷酸化，導(dǎo)致MMP-9的表達(dá)增加［11］。在肺癌細(xì)胞中，F(xiàn)AK通過激活ERK1/2-PI3K-AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致MMP-9和RhoA表達(dá)的增加，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的運動及侵襲［12］。我們的研究表明，AE能抑制MDA-MB-231細(xì)胞分泌MMP-9，其機制可能是AE下調(diào)FAK表達(dá)，F(xiàn)AK通過Ras、ERK1/2等中間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，抑制了MMP-9分泌。AE下調(diào)MMP-9分泌的機制，尚需進(jìn)一步的研究。

我們的實驗結(jié)果表明AE能抑制MDA-MB-231細(xì)胞體外侵襲等轉(zhuǎn)移相關(guān)能力，其作用機制與AE下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞FAK表達(dá)和MMP-9分泌有關(guān)。本研究結(jié)果提示AE具有開發(fā)為抗乳腺癌轉(zhuǎn)移藥物的潛能，但其深入的作用機理及體內(nèi)抗轉(zhuǎn)移的效果，尚需進(jìn)一步研究。

［1］王俊杰，付云芝.蘆薈中蒽醌化合物的提取和檢測及藥用價值研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(21):11131－3.

［1］Wang J J，F(xiàn)u Y Z.Research progress on extraction and detection and medicinal value of anthrone compounds in aloe［J］.J Anhui Agri Sci，2010，38(21):11131 －3.

［2］Chiu T H，Lai W W，Hsia T C，et al.Aloe-emodin induces cell death through S-phase arrest and caspase-dependent pathways in human tongue squamous cancer SCC-4 cells［J］.Anticancer Res，2009，29(11):4503－11.

［3］Lee H Z.Protein kinase C involvement in aloe-emodin-and emodin-induced apoptosis in lung carcinoma cell［J］.Br J Pharmacol，2001，134(5):1093－103.

［4］黃 蕊，姜琳琳，孫曉明，等.鈣調(diào)素拮抗劑EBB抑制ES-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用機制初探［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(5):242－5.

［4］Huang R，Jiang L L，Sun X M，et al.The metastasis suppressing ability and its mechanism of calmodulin antagonist EBB human metastatic ovarian clear cell line ES-2 ［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(5):242－5.

［5］魏 彩，秦宜德，鄭 欣，等.乳源免疫調(diào)節(jié)肽體外抑制人卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29(1):42－8.

［5］Wei C，Qin Y D，Zheng X，et al.Immunomodulating peptide from β-casein inhibis the invasion and migration of human ovarian papillary serous cystadenocarcinoma cell line SKOV3in vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(1):42 －8.

［6］Liao S J，Zhou Y H，Yuan Y，et al.Triggering of Toll-like receptor 4 on metastatic breast cancer cells promotes αvβ3-mediated adhesion and invasive migration ［J］.Breast Cancer Res Treat，2012，133(3):853－63.

［7］Zhu J H，Yuan Y，Li D，et al.Targeting nuclear factor-κB suppresses the negative effect of toll-like receptor 4 signaling on antimetastasis therapy based on targeting αvβ3 ［J］.Cancer Sci，2012，103(7):1319－26.

［8］Mitra S K，Mikolon D，Molina J E，et al.Intrinsic FAK activity and Y925 phosphorylation facilitate an angiogenic switch in tumors［J］.Oncogene，2006，25(44):5969 －84.

［9］何振輝.腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)人纖連蛋白CH50重組多肽表達(dá)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的研究［D］.武漢:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院，2009:99－105.

［9］He Z H.Adeno-associated virus-mediated expression of recombinant CBD-HepII polypeptide of human fibronectin inhibits tumor metastasis［D］.Wuhan:Tongji Medical College of Huazhong U-niversity of Science and Technology，2009:99 －105.

［10］Liotta L A，Stetler-Stevenson W G.Tumor invasion and metastasis:an imbalance of positive and negative regulation［J］.Cancer Res，1991，51(18 Suppl):5054s－9s.

［11］Chen J S，Huang X H，Wang Q，et al.Sonic hedgehog signaling pathway induces cell migration and invasion through focal adhesion kinase/AKT signaling-mediated activation of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 in liver cancer［J］.Carcinogenesis，2013，34(1):10－9.

［12］Meng X N，Jin Y，Yu Y，et al.Characterisation of fibronectin-mediated FAK signalling pathways in lung cancer cell migration and invasion［J］.Br J Cancer，2009，101(2):327 －34.