張 靜，王洪新，楊 娟，魯美麗，李勝陶，喻曉春

(1.遼寧醫(yī)學院 遼寧省心腦血管藥物重點實驗室，遼寧，錦州 121001;2.中國中醫(yī)科學院實驗中心，北京 100700)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是心臟對體內(nèi)外各種刺激產(chǎn)生的一種適應性反應，隨著疾病的進展，最終可導致心力衰竭［1］。β腎上腺素能受體是調(diào)節(jié)心臟功能的主要受體，其在心臟中的信號轉(zhuǎn)導機制一直是研究的熱點，β受體興奮后導致炎癥因子的活化，并且涉及多種心血管疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素(Iso)誘導心肌肥厚的過程中涉及炎癥反應，使機體炎癥因子如白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等含量增加［3］。有證據(jù)表明黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)具有一定的抗炎作用，可明顯減少脂多糖誘導的人單核細胞株THP21中IL-6的表達及分泌［4］。本實驗室已證明:① Iso可激活CaMKⅡ 信號通路誘導心肌細胞肥大［5］，② APS對Iso誘導心肌細胞肥大具有一定的保護作用［6］，其APS的劑量是本實驗 APS的參考依據(jù)。然而APS是否通過抑制CaMKⅡ信號通路保護心肌及CaMKⅡ在Iso誘導心肌細胞肥大所致炎癥反應中的作用，目前尚無報道。本實驗運用 10 μmol·L－1的Iso為誘導劑［7］，進一步探討APS對Iso誘導心肌細胞肥大的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品和試劑 出生1～3天的SD乳鼠，♀♂不拘，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003－0007。黃芪多糖為陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號:HQ090312，純度98%;Iso、PRO、二甲基亞砜(DMSO)﹑十二烷基硫酸鈉(SDS)﹑CaMKⅡ抑制劑KN93均購自美國sigma公司;低糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;小牛血清購自美國Hyclone公司;RT-PCR試劑盒、引物、Marker均購自大連寶生物工程有限公司;CaMKⅡδ一抗購自Santa Cruz;IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒購自 R＆D公司;其他試劑均為分析純。

1.2 體外乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng) 體積分數(shù)為0.75的乙醇消毒，無菌開胸，迅速取出心臟，置于盛有D-Hanks溶液培養(yǎng)皿中清洗，修剪心臟僅留心尖部分并剪成大小約為0.5～1.0 mm3的碎塊，加入0.8 g·L－1胰蛋白酶溶液，37℃分次恒溫消化，第一次10 min，棄上清，以后均為8 min，消化4～5次。將消化好的細胞置于體積分數(shù)為0.15小牛血清、0.84低糖DMEM和0.01雙抗(含濃度均為100 U·L－1的青霉素和鏈霉素)吹打均勻后，裝入25 cm2培養(yǎng)瓶(或24孔培養(yǎng)板)中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。采用差速貼壁法純化心肌細胞，然后將細胞調(diào)至所需密度(培養(yǎng)瓶為5×106，培養(yǎng)板為5×105)置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 分組及給藥方法 常規(guī)培養(yǎng)心肌細胞48 h后，為減少血清成分對實驗結(jié)果的影響，更換體積分數(shù)為0.0004小牛血清的低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞生長周期同步化后進行實驗。實驗所需藥品Iso、APS和PRO均為水溶性，三蒸水溶解后0.22 μm針式濾器除菌;KN93溶于DMSO，為消除DMSO對心肌細胞的毒性作用，其在培養(yǎng)基中的體積分數(shù)需小于0.001。給藥組APS、KN93和PRO預先孵育30 min，加入Iso，48 h后進行各指標的測定。實驗共分為 8 組:①正常對照組;②Iso(10 μmol·L－1);③KN93(0.2 μmol·L－1);④Iso+KN93;⑤Iso+APS(0.1 mg·L－1);⑥Iso+APS(1 mg·L－1);⑦Iso+APS(10 mg·L－1);⑧Iso+PRO(2 μmol·L－1)。

1.4 心肌細胞體積的測定 取“1.3”處理的各組細胞，PBS快速沖洗長滿細胞的培養(yǎng)孔，每孔加入質(zhì)量分數(shù)為0.1% 的胰蛋白酶，放入37℃ 恒溫箱中孵育10 min左右，隨后每孔加入含體積分數(shù)為0.1×102血清的培養(yǎng)基終止消化。將同組細胞合并收集注入一細胞室內(nèi)(該細胞室底部是一經(jīng)硅化的蓋玻片，防止心肌細胞貼壁)，在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察細胞，幾乎呈球形。用計算機CIAS大恒細胞圖像分析系統(tǒng)測量單個細胞的直徑，進而計算出細胞的體積。每孔隨機選擇4個視野，每個視野測20個細胞。

1.5 心肌細胞總蛋白質(zhì)含量的測定 取“1.3”處理的各組細胞，吸去各孔中的培養(yǎng)液，PBS溶液沖洗3次，加入SDS使細胞裂解，為減少去垢劑對實驗結(jié)果的影響，SDS的含量應低于0.01%。根據(jù)計數(shù)，每孔細胞數(shù)約為5×105個，采用 Bradford法測定細胞的總蛋白含量。

1.6 ELISA法檢測心肌細胞外液IL-6和TNF-α的含量 取“1.3”處理的各組細胞上清液，將試劑盒置于室溫平衡30 min，按照ELISA試劑盒說明進行操作，完畢后在全自動酶標儀于450 nm波長讀取吸光度值，繪制標準曲線，根據(jù)各標本吸光度值在標準曲線上得出相應的濃度。

1.7 RT-PCR法檢測心肌細胞 ANP mRNA的表達 收集“1.3”處理的各組細胞，加入 TRIzol試劑800 μl裂解細胞，收集細胞裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，用DEPC處理水回收總RNA。以質(zhì)量濃度為10 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計A260/A280鑒定RNA濃度和純度，純度以大于1.8為宜。取約1 μg總 RNA進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件為:30℃ 10 min;45℃ 30 min;95℃ 5 min。ANP 引物:up:5'-GGGCTCCTTCTCCATCAC-3'，down:5'-CCCTCAGTTTGCTTTTCA-3'(348 bp);內(nèi)參GAPDH的引物序列為:up:5'-AATGCATCCTGCCACCACCAACTGC-3'，down:5'-CCAGGCCATGTAGTAGGCCATGAGGTC-3'(550 bp)。PCR反應條件:94℃45 s，55℃ 50 s，72 ℃ 1 min 15 s。循環(huán)擴增結(jié)束后，取10 μl產(chǎn)物進行質(zhì)量濃度為20 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，置于凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和分析。

1.8 Western blot法測心肌細胞 CaMKⅡδ蛋白水平 收集“1.3”處理的各組細胞，BCA法蛋白定量。保證上樣量相同條件下計算出每組應吸取樣品上清的體積，用上樣緩沖液補至 80 μl，再加 100 μl溴酚藍染液煮沸4 min，然后各取10 μl樣品以及蛋白質(zhì)標準品點樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。初始電壓為90 V，觀察 Marker的移動情況，適時終止電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，然后取所需部分與稀釋過的一抗(1∶1 000)4℃雜交過夜，第2日用 TBST洗膜3次，然后室溫與二抗作用至少1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，上機檢測。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用單因素方差分析和LSD法。

2 結(jié)果

2.1 APS對心肌細胞形態(tài)學改變的影響 Fig 1顯示，在倒置相差顯微鏡下觀察，正常對照組心肌細胞呈梭形、三角形和不規(guī)則形，有突起，呈放射狀排列;Iso組細胞較為飽滿且明顯肥大，可見少量細胞碎片;KN93組(CaMKⅡ抑制劑 )細胞形態(tài)與正常對照組無明顯差異;Iso+KN93組和Iso+不同濃度黃芪多糖組均對肥大的心肌細胞有一定的改善作用，表現(xiàn)為細胞體積變小，細胞碎片減少，且黃芪多糖從低劑量(0.1 mg·L－1)、中劑量(1 mg·L－1)到高劑量組(10 mg·L－1)，保護作用依次增強，呈劑量依賴性。

2.2 APS對心肌細胞體積及蛋白含量的影響Tab 1顯示，與正常對照組相比，Iso組心肌細胞體積增大了88.3%，總蛋白含量增加了55.3%;KN93組細胞體積和總蛋白含量未見明顯改變，提示CaMKⅡ的抑制劑對正常心肌細胞無影響;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組心肌細胞體積分別減小了45.2%、44.7%、27.6%、35.2%、45.2%，細胞總蛋白含量分別降低了 33.9%、33.4%、13.5%、25.0%、34.7%;提示KN93組、PRO組和APS低、中、高劑量組均可對Iso誘導的心肌細胞肥大產(chǎn)生一定的抑制作用，且APS存在劑量依賴性。

Fig 1 Pictures of the cultured neonatal rat cardiomyocytes(×400)

Tab 1 Effects of different treatments on cell size and total protein content of cultured myocardial cells induced by Iso［±s，n=80(size)，n=6(protein)］

Tab 1 Effects of different treatments on cell size and total protein content of cultured myocardial cells induced by Iso［±s，n=80(size)，n=6(protein)］

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group Cell size/μm3 Protein/μg(in 5 ×105cells Normal 1170 ±112 17.15 ±1.1 Iso 10 μmol·L －1 2204 ±167＊＊ 26.63 ±1.6＊＊KN93 0.2 μmol·L －1 1181 ±141 17.28 ±1.1 Iso+KN93 1208 ±139## 17.59 ±1.3##Iso+APS 0.1 mg·L －1 1597 ±189## 23.03 ±1.7##Iso+APS 1 mg·L －1 1428 ±144##□ 19.98 ±2.7##□Iso+APS 10 mg·L －1 1203 ±116##△ 17.39 ±1.5##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 1218 ±156## 17.72 ±1.5##)

2.3 APS對心肌細胞外液中IL-6和TNF-α表達的影響 Tab 2顯示，與正常對照組相比，Iso組心肌細胞外液中IL-6的含量增加了65.9%，且TNF-α含量的增加大于100%;KN93組細胞外液中IL-6和TNF-α的含量未見明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組中IL-6和TNF-α的含量均明顯較少，且APS存在劑量依賴性;提示 APS可以減少炎癥因子 IL-6和TNF-α的釋放，保護心肌。

Tab 2 Effects of different treatments on expression of IL-6 and TNF-α in cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different treatments on expression of IL-6 and TNF-α in cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group IL-6/ng·L－1 TNF-α/ng·L －1 Normal 131.2 ±1.9 22.8 ±2.9 Iso 10 μmol·L－1 217.7 ±6.8＊＊ 68.4 ±4.7＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 138.4 ±2.8 25.3 ±2.3 Iso+KN93 141.7 ±1.8## 27.2 ±1.6##Iso+APS 0.1 mg·L －1 185.2 ±4.2## 36.4 ±3.3##Iso+APS 1 mg·L －1 163.7 ±4.7##□ 29.4 ±3.9##□Iso+APS 10 mg·L－1 140.0 ±2.4##△ 26.8 ±2.3##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 143.9 ±3.2## 28.4 ±3.4##

2.4 APS對心肌細胞ANP mRNA表達的影響Tab 3和Fig 2顯示，與正常對照組相比，Iso組心肌細胞ANP mRNA的表達明顯增高了46.9%;KN93組ANP mRNA的表達未見明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組ANP mRNA的表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義;表明KN93組、PRO組、黃芪多糖組均對Iso誘導的心肌細胞肥大有一定的抑制作用，提示阻斷CaMKⅡ信號通路可能對心肌有保護的作用。

2.5 APS對心肌細胞CaMKⅡδ蛋白表達的影響

Tab 4和Fig 3顯示，與正常對照組相比，Iso組CaMKⅡδ蛋白表達明顯增高了;KN93組蛋白表達未見明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組CaMKⅡδ蛋白表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義;提示黃芪多糖可能通過抑制CaMKⅡ信號通路的激活，從而達到保護心肌的作用。

Fig 2 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured neonatal rat cardiomyocytes

Tab 3 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

Tab 3 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group ANP mRNA(IA ANP/IA GAPDH)Normal 1.021 ±0.028 Iso 10 μmol·L－1 1.922 ±0.085＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 1.029 ±0.017 Iso+KN93 1.141 ±0.038##Iso+APS 0.1 mg·L －1 1.406 ±0.159##Iso+APS 1 mg·L －1 1.211 ±0.097##□Iso+APS 10 mg·L－1 1.047 ±0.153##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 1.351 ±0.172##

Tab 4 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

Tab 4 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group A CaMKⅡδ/A β-actin Normal 0.61 ±0.02 Iso 10 μmol·L－1 0.94 ±0.05＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 0.63 ±0.01 Iso+KN93 0.65 ±0.02##Iso+APS 0.1 mg·L －1 0.81 ±0.06##Iso+APS 1 mg·L －1 0.72 ±0.08##□Iso+APS 10 mg·L－1 0.64 ±0.06##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 0.67 ±0.05##

Fig 3 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured neonatal rat cardiomyocytes

3 討論

心肌肥厚是心臟對各種病理性刺激產(chǎn)生的一種適應性生理反應。最初，可能是心臟為適應正常的室壁應力和保持收縮功能，但這種適應過程可能逐步發(fā)展為擴張型心肌病、心肌纖維化、心律失常、心力衰竭甚至猝死［8］。研究發(fā)現(xiàn)［9］，心肌肥厚過程中，肥厚基因的表達增高，且有炎癥因子的過度表達。Serra等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Iso誘導的心肌肥厚中TNF-α和IL-6的表達水平增高，運動療法使促炎性因子明顯減少，改善心肌收縮力，抑制左心室肥厚，防止心室重塑，保護心肌。因此，炎癥在心肌肥厚中的作用是不能忽視的。

CaMKⅡ是一種普遍存在的、多效性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在心臟中以 δ亞型為主［11］。CaMKⅡ通過與鈣化的鈣調(diào)蛋白(Ca2+/CaM)結(jié)合，使其抑制性結(jié)構(gòu)域移位，發(fā)生自動磷酸化而被激活［12］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，持續(xù)的心肌損傷通過激活CaMKⅡ信號通路，使促炎基因表達，產(chǎn)生炎癥反應，進而發(fā)生心肌肥厚，因此，CaMKⅡ可以作為連接心肌肥厚和炎癥信號通路的樞紐。實驗表明，抑制CaMKⅡ的活性可以減少心肌肥厚、防止功能性重構(gòu)及心律失常的發(fā)生［14］。Singh 等［15］發(fā)現(xiàn)，在野生型大鼠后壁心肌梗死模型中，CaMKⅡ被氧化激活，肥厚的標志性基因的表達上調(diào)，促炎基因如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、補體因子 B(Cfb)的含量明顯增多，并且發(fā)生心肌細胞壞死和心肌纖維化。

本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Iso處理的心肌細胞體積增大、總蛋白含量增多及ANP mRNA的表達增高，表明肥大模型成功;APS和CaMKⅡ阻斷劑KN93均可明顯減少上述表現(xiàn)，除此之外，均可使CaMKⅡδ蛋白的表達降低，且APS的劑量越大，效果越明顯，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，提示阻斷CaMKⅡ可降低ANP mRNA的表達，抑制心肌肥厚;同時APS可通過阻斷CaMKⅡ有效抑制Iso誘導的心肌細胞肥大。實驗還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Iso處理的心肌細胞外液中IL-6和TNF-α的含量增加，APS和CaMKⅡ阻斷劑KN93均可減少炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，APS在此亦呈劑量依賴性，提示APS通過阻斷CaMKⅡ抑制炎癥因子的產(chǎn)生。故APS可以通過阻斷CaMKⅡ信號通路減少炎癥因子的產(chǎn)生，抑制炎癥反應和心肌細胞肥大，從而保護心肌。

眾多研究表明，心肌肥厚的過程中涉及CaMKⅡ的激活和炎癥反應，但APS是否可以通過減少炎癥反應阻斷CaMKⅡ達到保護心肌的作用，目前尚不清楚，本實驗通過研究黃芪多糖對CaMKⅡ信號通路的影響，進一步深入研究心肌肥厚的可能機制和中國傳統(tǒng)中藥黃芪的保護作用，為心肌肥厚等心血管疾病的防治提供新思路。黃芪多糖抑制心肌肥厚的過程中，是否涉及其它通路及是否與CaMKⅡ信號通路存在交互作用有待于進一步的研究。

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