袁祎琳，李云飛，2，*，梅 俊，王邦權(quán)，劉志宇

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心，上海200240）

藏靈菇（Tibetan kefir）是一種產(chǎn)自西藏的開菲爾粒，乳白色、膠質(zhì)狀的塊狀物，外形酷似小塊花椰菜[1-2]，包含由多種微生物組成的微生態(tài)群落，對(duì)牛奶有發(fā)酵作用。開菲爾粒是一種天然形成的混菌發(fā)酵系統(tǒng)，能夠?qū)εＨ榈冗M(jìn)行乳酸發(fā)酵及酒精發(fā)酵[3]。其發(fā)酵牛乳的風(fēng)味與普通酸牛乳有較大差別，除了具有發(fā)酵牛乳特有的酸味、香味，還有輕微醇香味及起泡性[4]。藏靈菇制作酸奶飲品在西藏、青海等地區(qū)有著悠久的歷史，其傳入內(nèi)地以來(lái)引起了更多人的關(guān)注。目前，對(duì)藏靈菇的研究剛剛起步，在菌相、風(fēng)味、微觀、物性等方面缺乏相關(guān)文獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)是將民間收集的藏靈菇作為發(fā)酵劑進(jìn)行牛奶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并跟蹤整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，研究了牛奶在發(fā)酵過(guò)程中的物性變化，為研究藏靈菇發(fā)酵牛奶奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏靈菇 西藏當(dāng)雄寺廟；純牛奶 光明乳業(yè)無(wú)抗生素巴氏奶。

DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海-恒科學(xué)儀器有限公司；METJLER TOLEDO實(shí)驗(yàn)pH計(jì)（FE20） 儀器（上海）有限公司；Thermo Scientific Heraeus Labofuge 400通用臺(tái)式離心機(jī) 上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；KDN-04A凱氏定氮儀 浙江托普儀器有限公司；SXT-06索氏抽提器 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；R/S plus流變儀 美國(guó)Brookfield公司；E-1045離子濺射儀（Ion Sputter） 日立Hitachi；Sirion 200場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM） 荷蘭FEI.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵前處理 日常培養(yǎng)藏靈菇將其放于巴氏奶中，置于28℃環(huán)境培養(yǎng)，每隔24h更換一次牛奶；在實(shí)驗(yàn)前一天將藏靈菇以10g/100mL接種于純牛乳中，在28℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，使之標(biāo)準(zhǔn)化，瀝出后用蒸餾水清洗藏靈菇表面，將白色附著物洗凈，置于蒸餾水中備用。所有備用藏靈菇在1h內(nèi)使用完。

1.2.2 發(fā)酵時(shí)間與溫度 按照15g/100mL進(jìn)行接種，然后將其放在恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為28℃和34℃，發(fā)酵時(shí)間為3、6、9、12、15、18、21、24、27h。

1.2.3 pH測(cè)定 每隔3h對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵液進(jìn)行pH測(cè)定。

1.2.4 保水率（WHC） 借鑒Harte[5]對(duì)于開菲爾的保水率測(cè)定方法，30mL發(fā)酵液置于50mL離心管中，以4500g，4℃離心18min，以下公式用于計(jì)算發(fā)酵液的保水率（WHC）：

式中：W1為離心之后乳清的質(zhì)量（g）；W2為所有發(fā)酵液的質(zhì)量（g）。每個(gè)梯度兩個(gè)平行。

1.2.5 脫水收縮 參考文獻(xiàn)[6]的方法：在50mL的離心管中加入約30g左右的藏靈菇發(fā)酵液，在4℃環(huán)境中靜置2h，然后在3400g（5804R）10℃條件下離心15min，以下公式用于計(jì)算脫水收縮率：

式中：W1為離心之后乳清的質(zhì)量（g）；W2為所有發(fā)酵液的質(zhì)量（g）。每個(gè)梯度三個(gè)平行。

1.2.6 黏度分析 采用R/S plus流變儀測(cè)定藏靈菇發(fā)酵液的黏度，參數(shù)設(shè)定為25℃，剪切速率變化為5min內(nèi)0～512s-1，轉(zhuǎn)子采用CC 25，每個(gè)樣品平行做3次。

1.2.7 化學(xué)成分分析 乳糖測(cè)定采用GB方法[7]，平行操作三次，得出平均消耗樣液的體積。以下公式計(jì)算樣品中乳糖的含量：

式中：X為樣品中乳糖的含量（mg/mL）；A為堿性酒石酸銅溶液（甲、乙液各半）相當(dāng)于乳糖的質(zhì)量（mg）；v為樣品的體積（mL）；V為測(cè)定時(shí)消耗樣品溶液的平均體積（mL）；100為樣品溶液總體積（mL）。

化學(xué)成分分析蛋白質(zhì)測(cè)定參考文獻(xiàn)[8]的方法，換算系數(shù)為6.38。

1.2.8 藏靈菇的掃描電鏡觀察 將藏靈菇切成小片，大小約5.5mm，將小片置于戊二醛溶液中，25℃放置4h，進(jìn)行固定。然后用磷酸緩沖液洗滌2次，每次15min，再分別用15%、30%、50%、70%的酒精各脫水15min，再用99.5%酒精脫水1h，將脫水巖心放入臨界點(diǎn)干燥機(jī)用液態(tài)二氧化碳進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，然后用離子膜覆膜機(jī)鍍金，最后用掃描電鏡觀察。

1.2.9 藏靈菇發(fā)酵乳和市售普通酸奶（光明莫斯利安）掃描電鏡觀察 將發(fā)酵乳和市售酸奶在干凈平整的玻璃板上涂片，涂片厚度約為2mm。在通風(fēng)的恒溫箱內(nèi)（28℃）下靜置48h以上，保證完全干燥。電鏡掃描前，撬取一小塊樣品薄片在離子覆膜機(jī)鍍金，最后用掃描電鏡觀察。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 利用SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性水平定在0.05%。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH的變化

原奶的pH為6.62，經(jīng)過(guò)27h的發(fā)酵，28℃環(huán)境中的純牛乳pH降低到3.93，34℃環(huán)境中的純牛乳pH降低到3.91。由圖1可觀察到，兩個(gè)溫度組的pH降低趨勢(shì)相似，12h之前pH的降低速度較快，12h之后降低比較平緩。此結(jié)果與王晴等[9]對(duì)kefir的研究結(jié)果相似，這是由于發(fā)酵初期乳酸菌（Lacteus）為優(yōu)勢(shì)菌種，大量利用乳糖并產(chǎn)酸，導(dǎo)致發(fā)酵乳的pH大幅降低。后期由于發(fā)酵乳的酸度過(guò)高抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，因此pH降低變緩。

根據(jù)SAS軟件的T TEST檢驗(yàn)，設(shè)計(jì)程序?qū)τ趦蓚€(gè)溫度進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示3～15h溫度（28、34℃）對(duì)于pH降低有顯著性影響（p＜0.05），18～27h這個(gè)時(shí)間段的溫度（28、34℃）對(duì)于pH也存在顯著性影響，但是顯著性不如前面的15h。整體上整個(gè)發(fā)酵階段溫度（28、34℃）組對(duì)于pH降低具有顯著性影響（p＜0.05），藏靈菇34℃發(fā)酵純牛奶產(chǎn)酸比28℃更快；對(duì)于發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示兩個(gè)溫度組的發(fā)酵時(shí)間對(duì)于pH降低具有顯著性影響（p＜0.01）。

并且，由于發(fā)酵溫度不同，菌相的變化和產(chǎn)物的組成以及產(chǎn)品的微觀結(jié)構(gòu)也會(huì)有很多差別，因此每個(gè)發(fā)酵階段產(chǎn)物的感官質(zhì)量也存在差別。

圖1 藏靈菇發(fā)酵純牛奶pHFig.1 The pH of Tibetan kefir fermentation samples

2.2 保水率和脫水收縮的變化

圖2 藏靈菇發(fā)酵純牛乳的保水率Fig.2 Water-holding capacity（WHC）of Tibetan kefir fermentation samples

2.2.1 保水率（WHC） 15～27h發(fā)酵純牛乳的WHC隨發(fā)酵時(shí)間而升高（見圖2），這是由于隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，藏靈菇發(fā)酵產(chǎn)物胞外多糖增多的緣故[10]，因?yàn)榘舛嗵牵‥PS）結(jié)合水的能力很強(qiáng)[11]。從圖2中看28℃比34℃有更高的保水率，這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)[12]的研究結(jié)果一致。28℃與34℃組的15h保水率分別為31.29%和30.48%，到了27h，兩組的保水率分別提升到了46.94%和46.22%。經(jīng)過(guò)SAS的ANOVA檢驗(yàn)，時(shí)間對(duì)于藏靈菇發(fā)酵純牛乳的保水率均有及其顯著的影響（p＜0.01）。3～12h發(fā)酵階段溫度組時(shí)間對(duì)于保水率沒(méi)有影響（p＞0.40），這可能是發(fā)酵不穩(wěn)定的緣故。整個(gè)發(fā)酵階段溫度對(duì)于保水率并沒(méi)有顯著性影響（p＞0.05）。

2.2.2 脫水收縮率 由圖3可知，發(fā)酵15～27h隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，脫水收縮率降低。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[13]報(bào)道，在發(fā)酵過(guò)程中pH降低，導(dǎo)致酪蛋白顆?？姑撍湛s能力增強(qiáng)，這應(yīng)該就是脫水收縮率隨著時(shí)間降低的原因。圖3中顯示，28℃發(fā)酵的脫水收縮率要比34℃組的略低。采用SAS的ANOVA檢測(cè)分析可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)于脫水收縮率的影響極其顯著（p＜0.01），而發(fā)酵溫度對(duì)于脫水收縮的影響不顯著（p＞0.05）。

圖3 藏靈菇發(fā)酵純牛乳的脫水收縮率Fig.3 The syneresis of Tibetan kefir fermentation samples

2.3 粘度的變化

從表1中可知，發(fā)酵乳的黏度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而提高。經(jīng)過(guò)ANOVA檢驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)于黏度的影響極其顯著（p＜0.01），發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的交互效應(yīng)對(duì)于黏度的影響也極其顯著（p＜0.01）?？梢钥吹降?5h時(shí)兩個(gè)溫度組的黏度均出現(xiàn)峰值，18h黏度又有所降低，18～27h的黏度再次穩(wěn)步上升。

藏靈菇發(fā)酵乳對(duì)于黏度的影響主要由胞外多糖和脂肪決定，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中胞外多糖主要由乳酸菌中的乳桿菌屬（Lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）的腸膜明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostocn.mesnteroidessubsp.dextranicum）產(chǎn)生[14]，腸膜明串珠菌葡聚糖亞種的最佳發(fā)酵溫度是20～30℃，提高溫度并有酵母（fermento）存在時(shí)，腸膜明串珠菌葡聚糖亞種活力增強(qiáng)。王晴等[9]研究發(fā)現(xiàn)，16h之后發(fā)酵乳中的酵母菌數(shù)明顯比12h之前的減少了很多，這點(diǎn)可能影響了明串珠菌葡聚糖亞種的生長(zhǎng)，導(dǎo)致了胞外多糖分泌暫時(shí)受阻。又由于根據(jù)王晴等[9]的生長(zhǎng)曲線，16h之后乳桿菌（Lactobacillus）的生長(zhǎng)速率高于12h之前，乳桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為37～42℃，具有很強(qiáng)的分泌胞外多糖的能力。故此研究18h之后發(fā)酵乳的粘度再次升高，且發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，34℃組比28℃組的黏度高的幅度越大。

經(jīng)過(guò)流變儀的檢測(cè)，市售酸奶的黏度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)全部呈對(duì)稱的開口向上的拋物線狀（見圖4），藏靈菇發(fā)酵液黏度曲線基本都呈開口向上的不對(duì)稱拋物線狀，且拋物線的最低點(diǎn)接近600s（轉(zhuǎn)子的剪切速率接近0s-1）處。這與藏靈菇發(fā)酵的成分和微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)，究其具體原因在下文電鏡掃描之后會(huì)加以解釋。酸牛乳都是觸變性流體，但是由于藏靈菇奶是由一個(gè)微生物群落發(fā)酵而成的，其成分要比市售酸奶復(fù)雜得多，并且從微觀結(jié)構(gòu)圖7（C、D、E）上也可以看出結(jié)構(gòu)致密平整，就造成了藏靈菇奶黏度恢復(fù)能力與市售酸奶有很大不同，從時(shí)間-黏度曲線上可以看出，黏度恢復(fù)能力比較滯后。

表1 藏靈菇發(fā)酵純牛乳的黏度對(duì)比結(jié)果Table 1 The viscosity of Tibetan kefir fermentation samples

圖4 市售普通酸奶和藏靈菇發(fā)酵液粘度（34℃，27h）Fig.4 The viscosity of Tibetan kefir fermentation samples andordinary yogurt（34℃，27h）

2.4 乳糖及蛋白質(zhì)的變化

2.4.1 乳糖 經(jīng)過(guò)檢測(cè)，純牛乳的乳糖含量為5.06%，經(jīng)過(guò)27h的發(fā)酵，28℃組的乳糖降低到3.42%，34℃組的乳糖降低至3.31%。從圖5中可以看出，12h之前乳糖急劇減少，15h之后乳糖雖仍在減少，但是降低的趨勢(shì)比較平緩?？赡芤?yàn)槿樘前l(fā)酵型酵母菌適合酸性生長(zhǎng)環(huán)境，而乳糖非發(fā)酵型酵母只能利用葡萄糖和半乳糖[15]，導(dǎo)致開菲爾乳中乳糖含量在發(fā)酵后期下降幅度降低。經(jīng)過(guò)SAS的ANOVA檢驗(yàn)可知，整個(gè)發(fā)酵階段的時(shí)間對(duì)于乳糖含量的影響極其顯著（p＜0.01），發(fā)酵溫度對(duì)于乳糖含量的影響也極其顯著（p＜0.01），但是12h之前發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的交互效應(yīng)對(duì)于乳糖的含量有影響，但是不顯著（p＞0.05），15h之后發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的交互效應(yīng)對(duì)于乳糖含量的無(wú)影響。

圖5 雪蓮菌發(fā)酵純牛乳乳糖含量趨勢(shì)圖Fig.5 lactose of the Tibetan kefir fermentation samples

2.4.2 蛋白質(zhì) 純牛乳的蛋白質(zhì)含量為2.92%，進(jìn)過(guò)27h的發(fā)酵，34℃組的蛋白質(zhì)含量升至3.87%，然而28℃組的蛋白質(zhì)含量升至了3.93%。有學(xué)者通過(guò)胃蛋白酶體外消化實(shí)驗(yàn)表明，開菲爾發(fā)酵酸奶中，非蛋白質(zhì)氮及游離氨基酸比普通牛奶多[16]；研究發(fā)現(xiàn)，在開菲爾發(fā)酵成熟過(guò)程中，蛋白質(zhì)發(fā)生變性和分解，游離氨基酸如脯氨酸、亮氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、組氨酸有限制增加，這可能為乳酸菌、醋酸菌中的紋膜醋酸桿菌（Acetobacter）或酵母菌作用的結(jié)果[17]。從圖6中可以看出，15h之前蛋白質(zhì)含量上升得比較快，18h之后，蛋白質(zhì)含量上升的趨勢(shì)逐漸平緩；兩個(gè)溫度組的蛋白質(zhì)含量上升的趨勢(shì)比較相似；并且28℃溫度下藏靈菇發(fā)酵純牛乳的蛋白質(zhì)含量高于34℃溫度組。

圖6 藏靈菇發(fā)酵純牛乳蛋白質(zhì)含量趨勢(shì)圖Fig.6 Protein content of the Tibetan kefir fermentation samples

經(jīng)過(guò)SAS的ANOVA分析，發(fā)酵時(shí)間對(duì)于蛋白質(zhì)含量變化的影響極其顯著（p＜0.01），發(fā)酵溫度（28℃，34℃）對(duì)于蛋白質(zhì)含量變化的影響不顯著（p＞0.05），發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)于蛋白質(zhì)含量的影響不顯著（p＞0.05）。0～3h，6～9h，15～18h發(fā)酵液的蛋白質(zhì)含量有比較大幅度的上升，ANOVA分析顯示這三個(gè)溫度組的蛋白質(zhì)含量具有顯著性差別。

2.5 電鏡掃描（SEM）結(jié)果及分析

從圖7（A）和圖7B中可以看到，雪蓮菌的外觀似花椰菜花蕾形狀，形成的過(guò)程為片狀結(jié)構(gòu)→渦旋狀→花椰菜[18]。對(duì)于此種藏靈菇的電鏡掃描外觀，菌種的表層棲息的菌種為乳糖發(fā)酵型酵母（Fermento.lactose fermentescentis）、嗜溫型乳球菌（Lactococcus.mesophilic）、嗜溫型乳桿菌（Lactobacillu.mesophilic）、嗜熱型乳桿菌（Lactobacillu.thermophilus），稍進(jìn)入里層酵母和乳桿菌的比例逐漸增大直至酵母占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，內(nèi)層主要為非乳糖發(fā)酵型酵母（Fermento.nonlactose fermentescentis）[19]。

圖7 藏靈菇、光明莫斯利安酸奶、藏靈菇發(fā)酵純牛乳（28℃，27h）組的電掃描照片F(xiàn)ig.7 SEM of Tibetan kefir，Bright Mosley Ann yogurt，Tibetan kefir fermentation samples（28℃，27h）

藏靈菇發(fā)酵準(zhǔn)牛乳27h之后發(fā)酵液的結(jié)構(gòu)非常致密平整（見圖7E），而市售酸奶就有比較多的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（見圖7C、D），空間結(jié)構(gòu)也比較復(fù)雜。這也許能解釋藏靈菇發(fā)酵液粘度曲線的特殊性，由于這樣的平整主要是由多糖造成的，多糖的交聯(lián)性會(huì)促進(jìn)蛋白顆粒之間的粘合，但是這樣的結(jié)構(gòu)一旦在高速剪切力的作用之下被破壞之后，恢復(fù)的速度就比較慢，這也是為什么藏靈菇發(fā)酵液的粘度曲線在剪切速率降低的情況下還是久久不能恢復(fù)的原因。在不添加任何增稠劑的情況下發(fā)酵而得的發(fā)酵液就具有如此獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，添加了一定量的甜味劑以后，成為一種比市售酸奶更加健康、綿滑、開胃的保健酸奶。藏靈菇發(fā)酵時(shí)間越久，發(fā)酵液的質(zhì)構(gòu)就更加致密[20]。發(fā)酵溫度也會(huì)影響到藏靈菇發(fā)酵乳的致密程度，溫度高（34℃）相較于溫度低（28℃）蛋白顆粒結(jié)合更加緊密，促進(jìn)了脫水收縮，但是平整度不如低溫發(fā)酵[21]。

3 結(jié)論

3.1 發(fā)酵溫度（28、34℃）和發(fā)酵時(shí)間對(duì)降低pH和增加黏度均有顯著性或者極顯著性影響，發(fā)酵至15h黏度達(dá)到最大值，分別為0.07676Pa·s和0.07930Pa·s。發(fā)酵溫度對(duì)保水率和脫水收縮率的影響表現(xiàn)為：發(fā)酵前期無(wú)顯著性影響，但是在發(fā)酵15h后有極顯著影響。

3.2 整個(gè)發(fā)酵階段，發(fā)酵時(shí)間對(duì)于乳糖的降低影響極其顯著（p＜0.01）；發(fā)酵溫度（28、34℃）對(duì)于乳糖的影響極其顯著（p＜0.01），34℃組強(qiáng)于28℃組；發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度的交互效應(yīng)對(duì)于乳糖的含量無(wú)顯著性影響；發(fā)酵時(shí)間對(duì)提高蛋白質(zhì)含量的影響極其顯著（p＜0.01），發(fā)酵溫度對(duì)于蛋白質(zhì)含量變化無(wú)顯著性影響（p＞0.05）。

3.3 酸牛乳是觸變性流體，但是由于藏靈菇奶是由一個(gè)微生物群落發(fā)酵而成的，其成分要比市售酸奶復(fù)雜得多，微觀結(jié)構(gòu)較市售酸奶致密平整，黏度恢復(fù)能力滯后。

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