韓 漾,吳明華,馬 立,梁 森

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210029;2.江蘇省中醫(yī)院腦病中心,南京210029)

腦梗死,又稱缺血性卒中,中醫(yī)稱之為卒中或中風(fēng),主要表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損癥狀而嚴(yán)重影響中老年患者身心健康和生活質(zhì)量的腦血管疾病,其中缺血性腦梗死占43.7%～78.9%[1]。其主要特點(diǎn)是高發(fā)病率、高致殘率、高病死率、高復(fù)發(fā)率,為社會(huì)及家庭帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。采用中藥早期治療,可預(yù)防腦梗死進(jìn)一步進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)旨在為中藥制劑通腦飲(組成:天麻、鉤藤、石斛、川芎、赤芍、制南星、天竺黃、僵蠶、地龍、水蛭)提供實(shí)驗(yàn)室研究依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

健康成年雄性SD大鼠(由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)24只,體質(zhì)量(300±30)g,隨機(jī)分為假

手術(shù)組8只,模型組16只。參照《現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究方法》[2]中所述的線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性缺血再灌注(MCAO)模型。假手術(shù)組手術(shù)步驟基本同MCAO模型大鼠,但只分離、暴露血管,不結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈,不插入釣魚(yú)線。將模型組大鼠于術(shù)后隨機(jī)分為對(duì)照組8只和給藥組8只,經(jīng)24 h后分別通過(guò)灌胃給藥法給予等量等滲生理鹽水或通腦飲(江蘇省中醫(yī)院提供),4 mL/次,2次/d,共14 d。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 神經(jīng)功能測(cè)定 參照《現(xiàn)代神經(jīng)科學(xué)研究方法》[2]采用神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(NSS),每組均設(shè)4個(gè)時(shí)間點(diǎn),于術(shù)后2 h,1 d,7 d,14 d進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)任何異常行為,0分;提起鼠尾,健側(cè)前肢內(nèi)旋、肩內(nèi)收為損傷較輕,1分;上述癥狀基礎(chǔ)上,置于光滑平面,向健側(cè)推擋時(shí)阻力減弱或動(dòng)物轉(zhuǎn)圈追尾爬行,為中度損傷,2分;提起鼠尾,向患側(cè)旋轉(zhuǎn),損傷較嚴(yán)重,3分;動(dòng)物處于精神抑制狀態(tài),不能進(jìn)行自發(fā)活動(dòng),4分。0分及4分的大鼠不予入組。

2.2 熒光定量PCR法檢測(cè)VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4基因表達(dá)水平 至14 d,模型組中每組選取3只斷頸處死,按照試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)SYBRGreenⅠ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR引物序列如下。VEGF,P1:5’-CAAAG CCAGCACATAGGAGAGA-3’,P2:5’-CTATCTTTCTTTGGTCTGCATTCAC-3’,PCR 產(chǎn)物為 71 bp;bFGF,P1:5’-CATCAAGGGAGTGTGTGCGA-3’,P2:5’-CCAGTTCGTTTC AGTGCCAC-3’,PCR 產(chǎn) 物 為 174 bp;SDF-1,P1:5’-GCATCAGTGACGGT AAGCCAG-3’,P2:5’-GCAACAATCTGAAGGGCACA-3’,PCR 產(chǎn)物為 7 133 bp;CXCR4,P1:5’-ACACCGTCAACCTTTACAGCA-3’,P2:5’-CAGGGATAGTC AGGAGGAGGG-3’,PCR 產(chǎn)物為 165 bp;rat actin,P1:5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’,P2:5’-TTT AATGTCACGCACGATTTC-3’,PCR產(chǎn)物為150 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 :模板 25 μ L,上 、下游引物各1 μ L,Sybr green I(20 ＊)0.5 μ L,模板 ＊(cDNA)2 μ L,DEPC,20.5 μ L,總反應(yīng)體積為50μ L。擴(kuò)增條件的設(shè)置:94℃預(yù)變性4min,94℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共循環(huán)35次,72℃檢測(cè)信號(hào)。熒光定量PCR儀:FTC2000(Canada)。所有樣本均重復(fù)檢測(cè)3次,計(jì)算出Ct值。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均已均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因互方差分析,再用 LSD法進(jìn)行 2組之間均數(shù)比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能評(píng)分 術(shù)后2 h、1 d、7 d、14 d,對(duì)照組評(píng)分分別為(2.5±0.5),(2.6±0.5),(1.8±0.3),(1.6±0.5)分;治療組分別為(2.7±0.5),(2.6±0.5),(1.5±0.5),(1±0.5)分;假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀,見(jiàn)圖1。

由圖分析可知:對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能缺損在1 d達(dá)到高峰,有自發(fā)恢復(fù)趨勢(shì);治療組大鼠神經(jīng)功能缺損隨時(shí)間逐漸改善,以術(shù)后7 d后改善顯著。2組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用 t檢驗(yàn),分別為:0.33,1,0.04,0.03,可見(jiàn)通腦飲能明顯改善大鼠急性腦梗死后的神經(jīng)功能功能缺損。

3.2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 治療組與對(duì)照組腦梗死組織中的VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4的CT值與內(nèi)參CT值檢測(cè)結(jié)果,并對(duì)各CT值采用2-△△CT進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,得到各基因的相對(duì)表達(dá)量,對(duì)照組:(0.479±0.128),(0.140±0.028),(0.469±0.108),(6.082±1.534),治療組:(0.982±0.134),(0.259±0.030),(0.959±0.191),(12.002±1.888),見(jiàn)圖 2。對(duì)各基因相對(duì)表達(dá)量行獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn),P均<0.05。由上可知,治療組較對(duì)照組大鼠腦梗死組織中VEGF,bFGF,SDF-1,CXCR4基因表達(dá)量明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。假手術(shù)組大鼠無(wú)腦梗死癥狀。

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

4 討論

中醫(yī)學(xué)的“中風(fēng)”包含西醫(yī)范疇的缺血性腦梗死、腦栓塞、腦出血等,其基本病機(jī)總屬陰陽(yáng)失調(diào),氣血逆亂。其病理因素不外虛(陰虛、血虛)、火(肝火、心火)、風(fēng)(肝風(fēng)、外風(fēng))、痰(風(fēng)痰、濕痰)、氣(氣滯、氣逆)、瘀(血瘀)六端,腦卒中急性期最多見(jiàn)的癥候是風(fēng)證、瘀證、痰證,痰瘀互結(jié)是腦卒中急性期發(fā)作后的基本病機(jī),可見(jiàn)腦卒中急性期,應(yīng)予息風(fēng)化痰、活血化瘀為主[3],《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中也明確指出:“化其腦中瘀血,方能奏效”。痰瘀阻絡(luò)方通腦飲,以經(jīng)典方劑滌痰湯、天麻鉤藤飲和通竅活血湯化裁加減而成,具有平肝息風(fēng)與活血化痰共治作用,使痰化而血行、血行則痰清,氣血流暢,以達(dá)治療之效[4]。此方經(jīng)過(guò)臨床療效觀察,如吳明華等[5]對(duì)40例患者應(yīng)用此方并進(jìn)行臨床觀察,證實(shí)其能顯著改善急性腦梗死患者的臨床神經(jīng)功能缺損,提高日常生活活動(dòng)能力。

眾所周知,缺血性腦梗死后可造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能的缺失,這種神經(jīng)功能的缺失是由于各種原因所致的局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙,導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死。缺血缺氧是觸發(fā)血管生成的重要因素,血管生成的啟動(dòng)需要眾多細(xì)胞因子的參與,主要包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子-α(SDF1-A)與其受體CXCR4。VEGF是一種特殊的內(nèi)皮細(xì)胞因子,具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)、抗凋亡等作用,與腦組織缺血損傷關(guān)系密切[6]。陳林等[7]經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果示VEGF因子的表達(dá)1/2 h出現(xiàn)上調(diào),并在24 h達(dá)到高峰,隨后表達(dá)有所下降,在168 h時(shí)表達(dá)又有所增加。bFGF在體內(nèi)廣泛分布,具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性,其促進(jìn)新的血管形成,bFGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管是通過(guò)VEGF來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在低氧狀態(tài)下,堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可促進(jìn)培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞VEGF的表達(dá)。SDF-1-CXCR4軸可通過(guò)干擾SDF-1-CXCR4軸使干細(xì)胞有骨髓流出進(jìn)入外周血液循環(huán),到達(dá)缺氧缺血性腦損傷部位,EPC能在缺血區(qū)分化成成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)新血管形成,從而改善缺血組織的血液供應(yīng)[8]。SDF-1/CXCR4軸同時(shí)也能促進(jìn)血管增生,表現(xiàn)在在SDF-1與VEGF之間存在相互作用,VEGF能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1的表達(dá),而SDF-1也能誘導(dǎo)VEFG的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠MCAO模型,神經(jīng)功能評(píng)分明確通腦飲對(duì)于大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)有積極作用,并通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)證實(shí)通腦飲可上調(diào)VEGF,bFGF,SDF-1/CXCR4基因表達(dá),初步明確了通腦飲可促進(jìn)急性腦梗死后血管的再生。

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