徐萬紋 ，史贏 ，王雄 ，范智峰 ，雷鐵池

（1.湖北省武漢市第三醫(yī)院，武漢430060；2.武漢大學人民醫(yī)院，武漢430060）

白癜風是一種常見的后天色素脫失性皮膚病[1-2]。雖然該疾病不會導致受累皮膚出現(xiàn)明顯的器質性功能障礙，但可對患者的身心健康造成嚴重影響，甚至阻礙患者的社會交往與擇業(yè)就業(yè)[2]。白癜風的發(fā)病機制至今仍不完全清楚，臨床上治療困難。由于毛囊隆突區(qū)細胞被認為存在免疫赦免（immune privilege）[3]，隆突區(qū)儲存的黑素干細胞（melanocyte precusor）在疾病發(fā)生中可能免遭破壞。這樣如何誘導有毛皮膚的白斑皮損出現(xiàn)毛囊復色（perifollicular repigmentation）是治療成功的關鍵[4-5]。有研究顯示白癜風患者對各種療法的無效率可高達50%[6]。推測原因可能關系到患者在接受治療前，臨床醫(yī)師無法評估皮損處的毛囊隆突區(qū)是否還存在可被誘導成熟的黑素干細胞。本研究用針尖皮膚切削術結合RT-PCR技術檢測白癜風皮損組織中黑素細胞譜系標記基因表達，旨在建立一種預測白癜風皮損可能出現(xiàn)毛囊復色的準確微創(chuàng)方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 該研究獲得武漢大學人民醫(yī)院倫理委員會的批準。選取4例健康志愿者和6例就診于武漢大學人民醫(yī)院皮膚科的皮損處于靜止期白癜風患者，所有受試者均簽署醫(yī)療知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 針尖皮膚切削術（needle biopsy）取材方法建立 患處皮膚常規(guī)活力碘液消毒后，75%醫(yī)用乙醇脫碘，鋪手術洞巾，暴露皮損區(qū)域及部分周圍正常皮膚，對白斑的中心、近邊緣和周邊“正常皮膚”處皮膚活檢。具體方式：用1 mL卡介苗注射器吸取2%利多卡因溶液0.5 mL，在取標本處皮下緩慢注射形成皮丘。針尖將皮丘輕輕挑起，手術刀平行皮膚表面切除皮丘頂端表皮（面積約為3～4 mm2），見點狀出血，用無菌紗布壓迫止血。直接將皮膚組織標本置入預裝有50 μL冷Trizol試劑（美國Invitogene公司）的EP管，用分析天平稱重。每次取標本前更換新的注射器、刀片和止血紗布，以避免基因污染。

1.2.2 RT-PCR檢測 用微量電動組織勻漿器（美國Kontes公司）對EP管中的皮膚組織進行勻漿，參照Trizol試劑說明書提取標本組織總RNA。用M-MLV逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）合成第一鏈cDNA。用Dct和Tyr引物行PCR實驗（引物序列見表1），內參照物為β-actin，以檢測皮損標本是否有相應基因的表達。PCR反應條件94℃預變性2 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，72℃終延伸2 min，其中變性到延伸過程循環(huán)35次。

2 結果

2.1 針尖皮膚切削術結合RT-PCR技術檢測皮膚組織中黑素細胞譜系標記基因方法的建立 用針尖皮膚切削術獲取3 mg和7 mg的組織標本并與負壓吸皰法采集的表皮片進行比較，結果顯示針頭切削術獲取的7 mg組織，經(jīng)Trizol法抽提到的總RNA，能在正常皮膚組織中檢測到多巴色素異構酶（Dct）、酪氨酸酶（Tyr）和管家基因β-肌動蛋白（ACTB）3種基因mRNA的表達。而在吸皰皮片中不能測到這些基因的表達。同時對10例針尖皮膚切削術后的局部傷口愈合進行了追蹤隨訪，1個月后10例均正常愈合，未見瘢痕形成，見圖1。

表1 黑素細胞相關基因引物序列

2.2 白癜風皮損組織中黑素細胞譜系標記基因的檢測 本研究通過對6例白癜風患者18塊組織標本進行黑素細胞譜系標記基因的檢測，結果皮損中心區(qū)檢測到3種模式，1例為：Dct+Tyr-ACTB+，見圖 2；4例為：Dct-Tyr-ACTB+；1例為：Dct+Tyr+ACTB+。對1例檢測結果為“Dct+Tyr-ACTB+”的患者隨訪，用希蘭UV308準分子光療饑（日本牛尾公司產）照射（200和300 mJ/cm2）2次，皮損即出現(xiàn)毛囊復色，見圖3。

3 討論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)有著色毳毛（黑毛）的白癜風皮損較有脫色毳毛（白毛）的皮損更易誘導出復色，且受累皮損發(fā)生在無毛區(qū)域（肢端型）較在有毛區(qū)域（尋常型）對復色誘導治療更顯抵抗[7]。在白癜風疾病發(fā)生過程毛囊內受免疫赦免而保護的殘存黑素細胞主要是一群無色素黑素細胞（amelanotic melanocyte），存在于毛囊的外毛根鞘，推測這群細胞活化可能參與白癜風毛囊復色[5，8]。最近的研究顯示毛囊隆突區(qū)還可能存在有神經(jīng)嵴衍生黑素干細胞 （neural crest-derived melanocyte stem cells，NSMSC），在體外用窄譜UVB可誘導NS-MSC分化為成熟黑素細胞，這一機制被認為也可能參與白癜風毛囊復色[9]。

Dct，小眼相關轉錄因子（MITF）和干細胞因子受體（c-Kit）等被認為是神經(jīng)嵴干細胞轉變?yōu)槎ㄏ蚍只某珊谒丶毎╩elanoblast）的特異性標記蛋白[10-12]。Nishimura等[11-12]用Dct啟動子控制半乳糖苷酶（Lac Z）報告基因表達構建Dct-Lac Z轉基因小鼠，Dct-Lac Z陽性細胞被視為進入黑素細胞譜系分化的最早期成黑素細胞，結果發(fā)現(xiàn)Dct-Lac Z陽性細胞專一存在于被立毛肌附著的毛囊隆突區(qū)，不含黑素顆粒和酪氨酸酶，呈小卵圓形。本研究用針尖皮膚切削術結合逆轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）技術檢測白癜風皮損組織中是否存在黑素細胞譜系標記基因表達，結果發(fā)現(xiàn)在白癜風皮損中心區(qū)檢測出3種基因表達模式，即Dct+Tyr-ACTB+，Dct-Tyr-ACTB+和 Dct+Tyr+ACTB+?！癉ct+Tyr-ACTB+”提示皮膚組織中可能存在有無色素黑素細胞；“Dct-Tyr-ACTB+”提示組織中完全缺乏成熟或幼稚黑素細胞；“Dct+Tyr+ACTB+”提示組織中可能存在功能障礙的黑素細胞。對1例檢測結果為“Dct+Tyr-ACTB+”的患者追蹤隨訪，用UV308準分子光照射（200 mJ/cm2和 300 mJ/cm2）2 次，皮損即觀察到出現(xiàn)毛囊復色。此外，我們還比較了針尖皮膚切削術與負壓吸皰法皮膚活檢對黑素細胞譜系標記基因檢測的影響。結果顯示負壓吸皰法不能檢測出上述標記基因，推測負壓吸皰致表皮裂解位置可能不能達到毛囊隆突區(qū)深度[13]。

總之，用針尖皮膚切削術結合RT-PCR技術檢測白癜風皮損組織中黑素細胞譜系標記基因表達，可作為預測白癜風皮損出現(xiàn)毛囊復色的一種準確微創(chuàng)方法。臨床上需要進一步大樣本測試與驗證基因檢出結果與誘導出現(xiàn)毛囊復色的關聯(lián)性，為白癜風病人臨床個體化治療提供實驗室參考依據(jù)。

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