江 莉 李慕軍 覃 莉

精子的發(fā)生是由精原細胞增殖分化形成精子的過程。如先天因素或后天疾病使精子生成的激素分泌或調(diào)控環(huán)節(jié)受到影響，即可造成精子發(fā)生障礙。目前評價男性生育力最客觀和直接的方法是對精液數(shù)量和活力進行常規(guī)分析，但對于一些復(fù)雜不明原因的不育癥，常規(guī)精液檢測或生化分析已經(jīng)無法滿足對其臨床診斷的需求[1]。而基因診斷可以為這些復(fù)雜病例的診斷提供一定的參考[2]。本研究應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）的方法，從基因表達水平探討主要表達于睪丸的富含半胱氨酸分泌蛋白基因-2（cysteine-rich secretory protein 2，CRISP2）在不同類型精子發(fā)生障礙人群中mRNA的轉(zhuǎn)錄表達情況，及其與精子發(fā)生障礙的相關(guān)性，為闡明不同類型男性不育的分子機制提供初步的研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 資料來源 選擇2012年1月—6月來我醫(yī)院生殖中心就診的男性不育患者150例，精液常規(guī)檢查按照WHO人類精液及精子—宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊（1999年，第4版）標準進行，精子形態(tài)學(xué)均未見異常。平素體健、無家族性遺傳病及性功能障礙病史、無不良生活習(xí)慣（吸煙、嗜酒、吸毒等），外生殖器及術(shù)前體檢無明顯異常，無精索靜脈曲張和精道感染患者，無其他系統(tǒng)疾病。研究對象均取得本人同意，簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會討論。

1.1.2 分組 正常精液組50例，精液量2～6 mL，呈灰白色或淡黃色，pH值7.2～7.8，60 min內(nèi)液化，精子密度≥20×106/mL，精子活力A級≥25%或A+B級≥50%。弱精子組50例，精子活力A+B級lt;5%。少精子組50例，精子密度lt;5×106/mL。

1.2 方法

1.2.1 精液收集與分離 收集各組精液，液化后經(jīng)95%、76%、57%和47.5%的硅膠顆?；鞈乙海≒ercoll分層液）非連續(xù)梯度離心，離心條件為300×g，20 min。然后用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，每次600×g，5 min，吸去上清，留沉淀于管底，儲存于-80℃?zhèn)溆?，用于提取精子總RNA。

1.2.2 總RNA提取 ?。?.2～1.0）×107個精子按照AxyPrep總RNA小量制備試劑盒（Axygen，杭州）的方法提取精子總RNA。紫外吸收法測定RNA在260 nm和280 nm處的吸光度（A）。于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA合成 采用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（Fermentas公司，美國）進行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.4 qRT-PCR測定基因表達水平 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：CRISP2（產(chǎn)物約154 bp），上 游 5′-ATCCCGCTTTTACTGCTTTGTT-3′,下 游 5′-CACCTTTGGGCATTCGTTGT-3′；GAPDH（產(chǎn)物248 bp），上游5′-GGTCGTATTGGGCGCCTGGT-3′，下游 5′-TACTCAGC?GCCAGCATCGCC-3′。CRISP2與內(nèi)參GAPDH基因同時進行PCR擴增，每次PCR擴增均加入同一個正常組的樣本作為參照樣本。2個基因的反應(yīng)體系均為20 μL，其中Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物終濃度0.3 μmol/L，其余體積用雙蒸水補足。CRISP2的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，然后95℃15 s，60℃1 min，進行40個循環(huán)；GAPDH的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，然后95℃ 15 s，62℃ 1 min，進行40個循環(huán)；每次循環(huán)結(jié)束時收集熒光。每個樣本進行3次重復(fù)測量以保證結(jié)果的準確。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進行分析，閾值設(shè)定在指數(shù)擴增期，2個基因均為0.2，3次重復(fù)測量的平均實時定量值即為相對表達量（relative quantity，RQ）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以±ss表示，3組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 不同組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），少精子組精子密度低于正常組，弱精子組活力A+B級、活力A級低于正常組（均P＜0.05），見表1。

Table 1 Comparison of clinical data between three groups表1 不同組間臨床資料比較 （n=50，x±s）

2.2 CRISP2在3組精子中的轉(zhuǎn)錄水平比較 由擴增曲線（圖1、2）和融解曲線（圖3、4）可見，CRISP2及內(nèi)參基因GAPDH擴增的特異性均較強。CRISP2相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=225.516，Plt;0.001）。正常組（10.281±2.173）及少精子組（9.420±2.794）高于弱精組（2.092±0.969，均P＜0.05），而前2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

3.1 不同類型精子發(fā)生障礙的表觀遺傳學(xué)分子機制 個體發(fā)育過程中，主要的表觀遺傳學(xué)改變發(fā)生在生殖細胞發(fā)育和著床前胚胎發(fā)育階段[3]。在目前輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）中的體外培養(yǎng)條件下，胚胎在超促排卵、體外培養(yǎng)和操作等因素的影響下，可能使正常的印記受抑制[4]，從而影響胚胎植入、胎盤形成、器官形成和胎兒生長等[5]。Kobayashi等[6]研究發(fā)現(xiàn)在少精子癥患者中印記異常和DNA序列突變較為普遍，提示ART所產(chǎn)生個體印記異常概率的增加，在一定程度上可能由于男性精子本身已經(jīng)存在印記突變的基因，因此有必要進一步研究正常健康男性精子與不育癥患者精子在分子水平上的差異。筆者的前期研究應(yīng)用高密度全基因組甲基化芯片對不同類型精子發(fā)生障礙異常甲基化基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)弱精子、少精子癥組的全基因甲基化水平均高于正常組。精子基因DNA甲基化通過其特定的化學(xué)修飾方式，可能關(guān)閉了某些基因的活性，使DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合力下降，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平降低，影響相關(guān)基因蛋白表達，隨之影響精子的發(fā)生[7]。

3.2 CRISP2在精子發(fā)生中的作用 CRISP2屬于CRISP家族成員之一。CRISPs在進化上非常保守，序列上呈現(xiàn)高度同源，在雄性生殖系統(tǒng)特異性高表達，尤其是在睪丸、附睪中[8]，提示CRISP2的作用可能與精子發(fā)生有關(guān)。免疫組織化學(xué)研究證實，CRISP2具體定位于成熟睪丸曲精細管內(nèi)側(cè)的中央?yún)^(qū)[9]，而在精子細胞中，精子的頂體以及精子的尾部是CRISP2蛋白的主要定位點，而且以精子尾部主段、中段外周的致密纖維（outer dense fibers，ODFs）和主段纖維鞘為主[10]，這暗示了CRISP2可能與精子活力有一定關(guān)系，還可能參與了精子功能的調(diào)控。CRISP2蛋白可能通過干預(yù)精子細胞膜內(nèi)外的鈣離子濃度，參與精子功能的調(diào)節(jié)，如精子活力的調(diào)節(jié)、精子獲能、頂體反應(yīng)等[11-13]。此外，CRISP2還參與了配子之間的相互作用[14]，可能影響受精及生殖生物學(xué)過程。Cohen等[15]報道，CRISP1、CRISP2對精卵融合有促進作用。Busso等[16]通過構(gòu)建小鼠模型，應(yīng)用間接免疫熒光和蛋白質(zhì)實驗方法，結(jié)果提示CRISP2可能參與了頂體內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成，從而影響精子獲能和頂體反應(yīng)；CRISP2還通過結(jié)合卵子的相關(guān)互補位點協(xié)助生物的受精過程，但這些作用的機制尚未清楚。

3.3 CRISP2基因表達與男性不育的關(guān)系 由于精子染色質(zhì)處于高度濃縮狀態(tài)，一直以來被認為是一種轉(zhuǎn)錄沉默的細胞，即DNA分子中胞嘧啶的甲基化使基因轉(zhuǎn)錄受阻。本研究通過qRT-PCR證實了CRISP2在精子細胞中的表達，這些mRNA的存在一定程度上表明了編碼這些蛋白的基因在精子生成的過程中得到了轉(zhuǎn)錄。本研究顯示，CRISP2基因在弱精子癥患者精子中的相對表達量顯著低于正常組。由此推斷精子活力低下可能與CRISP2基因的低轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，CRISP2基因表達的減少可能導(dǎo)致精子活力下降，提示CRISP2基因有望成為潛在的分子診斷標志物。這與Wang等[17-18]采用基因芯片技術(shù)篩查精子發(fā)生相關(guān)基因所得出的研究結(jié)果是一致的。而在本研究中，少精子癥患者來源精子中CRISP2的mRNA水平略低于正常精子組，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，也提示少精子癥的發(fā)生可能與CRISP2基因尚無直接聯(lián)系。少精子癥可能是由其他原因引起，如近年研究較多的細胞凋亡相關(guān)基因、Y染色體上的基因等。

正常的精子發(fā)生受多種因素調(diào)控，欲進一步了解CRISP2基因在人類精子發(fā)生過程中的具體機制，還需要對該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的基因突變或其表觀修飾的甲基化狀態(tài)進行深入的分析，并進一步通過相應(yīng)的蛋白水平來證實。此外，因樣本數(shù)較少，尚不能除外取材導(dǎo)致的偏差，但初步可以推斷，CRISP2基因mRNA表達水平下調(diào)可能與精子活力下降有關(guān)，提示CRISP2基因有望成為潛在的分子診斷標志物，可能為今后研究弱精子癥發(fā)生的相關(guān)分子機制提供參考。

Figure 1 Amplification curves of CRISP2圖1 CRISP2基因擴增曲線

Figure 2 Amplification curves of GAPDH圖2GAPDH擴增曲線

Figure 3 Melting curve of CRISP2圖3 CRISP2基因熔解曲線

Figure 4 Melting curves of GAPDH圖4GAPDH熔解曲線

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