馬菲菲 張慶瑜 王 濤 康春生 徐 蓉 蔡鳳英 宋小妹

磷脂酰肌醇3－激酶催化亞基α（PIK3CA）基因位于3號染色體長臂26號位點3區(qū)，全長34 kb，編碼IA型磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）的p110α催化亞基，即PI3Kp110α蛋白。目前普遍認(rèn)為PIK3CA的突變在肺癌[1]、腦癌、乳腺癌、結(jié)腸癌[2]等多種實體腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但有研究證實，PIK3CA基因突變在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用不明顯[3]，胃癌中PIK3CA表達(dá)是否增強，與腫瘤病理分型存在何種關(guān)系，在PI3K/Akt信號通路中起到何種作用尚不清楚[4]。本研究采用組織芯片和免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測和分析了不同病理級別胃腺癌、癌旁組織和正常胃黏膜中的PIK3CA及IA型PI3K/Akt通路主要成員絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（pAkt）、細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原（ki-67）的表達(dá)及相互關(guān)系，旨在探討其在腫瘤增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）組織芯片。組織芯片購自西安艾麗娜生物科技有限公司，包含胃腺癌及其匹配癌旁組織與正常胃黏膜組織組合微陣列，其中45例腺癌及其匹配的癌旁組織每例2點，10例正常組織每例1點。點數(shù)100，10×10排列，直徑1 mm，厚度5 μm。在45例腫瘤樣本中男33例，女12例，年齡30～78歲，中位年齡59歲，其中低分化腺癌8例，中分化腺癌28例，高分化腺癌9例；10例正常組織樣本中男9例，女1例，年齡16～50歲，中位年齡37歲。芯片的每個點樣均經(jīng)過病理診斷。（2）試劑。鼠抗人PIK3CA單克隆抗體購自Abnova公司、兔抗人pAkt(1∶100)多克隆抗體、鼠抗人ki-67(1∶100)單克隆抗體購自Santa Cruz公司，山羊抗兔HRP二抗、馬抗小鼠HRP二抗、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 組織芯片脫蠟至水，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，抗原修復(fù)、室溫孵育后，依次加1∶100稀釋的一抗，棄一抗，0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.4)沖洗，3 min，連續(xù)3次，加1∶100稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37℃孵育30 min，滴加1∶100稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗，5 min，連續(xù)3次。常規(guī)脫水，透明、樹脂封片，顯微鏡觀察、拍照。以上免疫染色以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 PIK3CA、pAkt胞漿胞核出現(xiàn)DAB著色為陽性表達(dá)，ki-67只有細(xì)胞核著色時視為陽性表達(dá)，用裝有目鏡網(wǎng)格微測尺的200倍視野計數(shù)8個網(wǎng)格中的PIK3CA、pAkt、ki-67蛋白表達(dá)陽性和陰性的腫瘤細(xì)胞數(shù)，按各種蛋白陽性腫瘤細(xì)胞占所有腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比，將其分為4個等級：無陽性細(xì)胞為-，陽性細(xì)胞lt;30%為+，陽性細(xì)胞30%～60%為++，陽性細(xì)胞gt;60%為+++。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，各組間差異比較采用R×C列聯(lián)表資料的χ2檢驗，蛋白陽性表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)進(jìn)行分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌、癌旁組織、正常胃黏膜組織中PIK3CA、pAkt、ki-67的表達(dá) 胃腺癌組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色以+++為主，呈彌漫的棕黃色或棕褐色染色，相應(yīng)的癌旁組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色以++～+++為主，呈小灶或彌漫的棕黃色或棕褐色染色，正常胃黏膜組織中PIK3CA、pAkt、ki-67免疫組化染色陽性者均為+，點狀棕黃色或棕褐色染色，見圖1～3。PIK3CA、pAkt、ki-67在胃癌及其癌旁組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。3種組織中PIK3CA與pAkt、ki-67表達(dá)均呈正相關(guān)（rs分別為0.916、0.945，均Plt;0.01），ki-67、pAkt表達(dá)亦呈正相關(guān)（rs=0.890,Plt;0.01）。

Table 1 Expressions of PIK3CA,pAkt and ki-67 in gastric carcinoma and adjacent tissues and normal gastric tissues表1 PIK3CA、pAkt和ki-67在胃癌及其癌旁組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)

2.2 不同病理級別胃腺癌中PIK3CA、pAkt、ki-67的表達(dá)情況 PIK3CA、pAkt、ki-67在低分化腺癌黏膜組織中染色以++～+++為主，呈彌漫的棕黃色或棕褐色染色，在中分化腺癌黏膜組織中染色以+～+++為主，呈小灶或彌漫的棕黃色或棕褐色染色，在高分化腺癌黏膜組織中染色多數(shù)為陰性，見圖1～3。PIK3CA、pAkt、ki-67在不同病理級別胃癌中表達(dá)的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。胃腺癌組織中PIK3CA與pAkt、ki-67表達(dá)均呈正相關(guān)（rs分別為0.885、0.934，均Plt;0.01），ki-67、pAkt表達(dá)亦呈正相關(guān)（rs=0.833,Plt;0.01）。

Table 2 Expressions of PIK3CA,pAkt and ki-67 in different pathological grades of gastric carcinoma表2 PIK3CA、pAkt和ki-67在不同病理級別胃癌中的表達(dá)

3 討論

3.1 胃癌組織中PIK3CA表達(dá)與腫瘤發(fā)病的關(guān)系 本研究中PIK3CA在胃癌及其癌旁組織的陽性表達(dá)率明顯高于正常胃黏膜組織，提示PIK3CA的過度表達(dá)在胃癌的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用。PIK3CA與pAkt在不同病理組織中表達(dá)的正相關(guān)，則進(jìn)一步說明PIK3CA表達(dá)水平對PI3K/Akt信號通路活性存在影響，以往研究表明PIK3CA編碼PI3K的催化亞基p110α，是PI3K/Akt信號通路中重要組成部分[5]，由此推斷胃腫瘤組織中PIK3CA表達(dá)水平上調(diào)導(dǎo)致PI3Kp110α的催化活性增強，促使Akt磷酸化，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)了胃腫瘤的發(fā)病。另外，ki-67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原[6]，與細(xì)胞周期密切相關(guān)，能較好地反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性。本研究中PIK3CA與ki-67在不同病理組織中表達(dá)的正相關(guān)，提示PIK3CA表達(dá)水平上調(diào)可能間接地促進(jìn)了胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖。

3.2 胃癌組織中PIK3CA表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系 本研究顯示不同病理級別的胃腺癌組織中PIK3CA表達(dá)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明PIK3CA高表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度存在關(guān)聯(lián)，越來越多的研究證明，PI3K/Akt信號通路中pAkt在調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)程過程中起了重要作用，如細(xì)胞生長和增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞運動和侵襲，其機制可能為Akt的持續(xù)性表達(dá)能誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，賦予了組織侵襲和轉(zhuǎn)移所需的運動性[7]。本研究中PIK3CA與pAkt的表達(dá)在不同病理分級的胃腫瘤組織中呈正相關(guān)，且PIK3CA、pAkt蛋白的表達(dá)陽性程度隨胃腺癌的惡性程度的增高而增高，由此推測PIK3CA在胃腫瘤的增殖與分化中發(fā)揮了重要作用，其表達(dá)上調(diào)使其下游靶向分子Akt過度激活，進(jìn)而產(chǎn)生一系列生物學(xué)行為。除此之外，本研究中，ki-67的表達(dá)也與PIK3CA、pAkt者之間存在正相關(guān)關(guān)系，說明在胃癌的發(fā)病中PIK3CA與腫瘤的增殖密切相關(guān)，其機制可能是PIK3CA作為PI3K/Akt信號通路的始動因子，促使Akt磷酸化，進(jìn)而激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)胃癌增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測這3個指標(biāo)的表達(dá)程度，將進(jìn)一步提高胃腫瘤的早期診斷率，估計患者預(yù)后，指導(dǎo)治療。

Figure 1 Expressions of PIK3CA in different gastric tissues（Envision method×200）圖1 PIK3CA在不同組織中的表達(dá)（Envision法×200）

Figure 3 Expressions of ki-67 in different gastric tissues（Envision method×200）圖3 ki-67在不同組織中的表達(dá)（Envision法×200）

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