張立峰，劉燦仿（邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥劑教研室，河北邢臺 054000）

利塞膦酸鈉原料藥質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)采用國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)[1]，該標(biāo)準(zhǔn)中含量采用電位滴定法測定，操作煩瑣，不適合常規(guī)檢測。同時(shí)，雖有文獻(xiàn)[2-9]報(bào)道采用高效液相色譜（HPLC）法檢測雙膦酸鹽類藥物的含量，但由于該藥中含有較多離子基團(tuán)，故采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法很難在固定相上保留這些基團(tuán)，從而影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。筆者經(jīng)過多次試驗(yàn)，建立了采用離子對反相（RP）-HPLC法測定利塞膦酸鈉原料藥及其注射劑含量的方法以及對其合成過程中殘余的原料2-（3-吡啶）乙酸和其他氧化分解產(chǎn)物的分離分析方法，從而為該藥的質(zhì)量控制提供了一種可靠的分析手段。

1 材料

液相色譜儀系統(tǒng)包括SP8810型輸液泵、SP8450型紫外-可見檢測器（美國光譜-物理公司）；HW-2000色譜工作站（南京千譜軟件有限公司）；Rheodyne 7725i型六通進(jìn)樣閥（美國Rheodyne公司）。

利塞膦酸鈉對照品（批號：20110716，采用電位滴定法測定純度：99.67%）、2-（3-吡啶）乙酸對照品（批號：20110324，采用HPLC法測定純度：99.49%）均由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供；利塞膦酸鈉原料藥（批號：20110314、20110325、20110406，純度：均＞99%）、注射用利塞膦酸鈉（批號：20110811、20110813、20110815，規(guī)格：每支5 mg）、利塞膦酸鈉注射液（批號：20120107、20120110、20120117，規(guī)格：5 mg∶2 ml）均由河北醫(yī)科大學(xué)制藥廠提供；四丁基溴化銨、磷酸二氫鈉均為分析純；試驗(yàn)用水均使用二次重蒸水；甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-5 mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液（含6 mmol/L離子對試劑四丁基溴化銨溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0）（20∶80，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：240 nm；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備。稱取利塞膦酸鈉對照品約25 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加水溶解、稀釋、定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度約為1.0 mg/ml的對照品貯備液，再用流動相稀釋即得質(zhì)量濃度分別約為8.00、10.00、12.00 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備。稱取利塞膦酸鈉原料藥或注射用利塞膦酸鈉約25 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入流動相稀釋得質(zhì)量濃度約為1.0 mg/ml的供試品貯備液，再用流動相稀釋得質(zhì)量濃度約為10.00 μg/ml的供試品溶液。

精密量取利塞膦酸鈉注射液約10 ml，置于25 ml量瓶中，加入流動相稀釋得質(zhì)量濃度約為1.0 mg/ml的供試品貯備液，再用流動相稀釋得質(zhì)量濃度約為10.00 μg/ml的供試品溶液。

我們把高層建筑可以看作是固定在地面上的一個(gè)懸臂結(jié)構(gòu)，它一方面受垂直荷載作用，另一方面受水平荷載作用。其中，垂直荷載使結(jié)構(gòu)產(chǎn)生軸力，其大小與建筑物高度基本呈線性關(guān)系；水平荷載使結(jié)構(gòu)產(chǎn)生彎矩，其大小與建筑物高度基本呈二次方變化。一般情況下，對地震作用效應(yīng)影響較大的是水平荷載，高層建筑抗震結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)首先要保證建筑物的結(jié)構(gòu)要有較大剛度。高層建筑結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的主要矛盾就是抗水平力，我們應(yīng)根據(jù)抗震等級和水平荷載的分布設(shè)計(jì)采用不同的結(jié)構(gòu)體系。

稱取2-（3-吡啶）乙酸對照品25 mg，精密稱定，置于25 ml量瓶中，加入流動相稀釋得濃度約為1.0 mg/ml的溶液備用。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取利塞膦酸鈉對照品貯備液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣測定，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（c）作圖，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A＝7.22×103+2.82×103c（r＝0.9998）。表明利塞膦酸鈉檢測質(zhì)量濃度線性范圍為79.96～799.6 μg/ml。

2.4 穩(wěn)定性考察

取注射用利塞膦酸鈉供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果RSD＝0.4%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次測定。結(jié)果峰面積值RSD＝0.3%（n＝5），表明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同批注射用利塞膦酸鈉樣品5份，制備供試品溶液，進(jìn)樣。結(jié)果平均含量RSD＝0.5%（n＝5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

取注射用利塞膦酸鈉同批樣品，按測試濃度的80%、100%、120%3個(gè)梯度分別加入對照品，每個(gè)質(zhì)量濃度取3份樣品，同法操作，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1Results of recovery tests（n＝3）

2.8 樣品含量測定

準(zhǔn)確稱取注射用利塞膦酸鈉及對照品適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液、對照品溶液，進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2Content determination of samples（n＝3）

2.9 色譜條件的篩選

2.9.1 色譜柱的選擇。分別以Hypersil C8和Hypersil C18柱作固定相，考察磷酸二氫鈉緩沖液濃度（5 mmol/L）、流動相pH值（7.0）及甲醇的體積分?jǐn)?shù)（20%）一定時(shí)，增加流動相中離子對試劑（同時(shí)有減尾劑的作用）四丁基溴化銨溶液濃度（0～8 mmol/L）對利塞膦酸鈉峰形的改善情況。結(jié)果顯示，以Hypersil C18作固定相，利塞膦酸鈉的峰形較差且難以改善；而以Hypersil C8作固定相，增加離子對試劑濃度，峰形得到明顯改善，能夠滿足要求。因此最終以Hypersil C8柱作為固定相。

2.9.2 影響色譜行為的因素考察。流動相的pH值、離子對試劑濃度、有機(jī)改性劑的體積分?jǐn)?shù)及緩沖液濃度對利塞膦酸鈉及其有關(guān)化合物[主要指2-（3-吡啶）乙酸]的保留行為有較大的影響。為了獲得最佳的分離效果，筆者考察了這些因素對其色譜行為的影響。

（1）pH值的影響。利塞膦酸為四元有機(jī)酸，其水溶液顯酸性（體積分?jǐn)?shù)為0.7%的利塞膦酸水溶液的pH值約為2.0）；相對于酸性較強(qiáng)的利塞膦酸而言，其合成原料藥中的殘留物2-（3-吡啶）乙酸是一種非常弱的酸，因此要同時(shí)使利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸在離子對色譜中保留，并使利塞膦酸鈉與其有關(guān)化合物得到良好的分離，關(guān)鍵是選擇合適的pH值。當(dāng)四丁基溴化銨濃度（6 mmol/L）、磷酸二氫鈉緩沖液濃度（5 mmol/L）及甲醇的體積分?jǐn)?shù)（20%）一定時(shí)，流動相pH值在4.0～7.5時(shí)對利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸保留行為的影響見圖1A。

圖1 流動相對利塞膦酸鈉、2（-3-吡啶）乙酸的保留與分離的影響a.利塞膦酸鈉；b.2（-3-吡啶）乙酸Fig 1 Influences of the mobile phase on the retention and separation of RS and 2-（3-pyridine）acetic acida.RS；b.2（-3-pyridine）acetic acid

由圖1A可知，隨著流動相pH值的增加，利塞膦酸鈉、2-（3-吡啶）乙酸在柱上保留都增加；當(dāng)pH≥7.0時(shí)，2-（3-吡啶）乙酸的保留因子k＞1，說明只有在較高pH條件下，2-（3-吡啶）乙酸才以陰離子狀態(tài)存在，從而可以與四丁基銨陽離子形成中性離子對，在C8柱上得到良好的保留。兼顧到合適的保留時(shí)間與良好的分離情況，最終選擇pH 7.0作為分離條件（當(dāng)pH＞7.0時(shí)，流動相對C8柱的損害較大）。

（2）離子對試劑濃度的影響。當(dāng)磷酸二氫鈉緩沖液濃度（5 mmol/L）、流動相pH值（7.0）及甲醇的體積分?jǐn)?shù)（20%）一定時(shí)，離子對試劑四丁基溴化銨濃度為0～8 mmol/L時(shí)對利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸保留行為的影響見圖1B。

由圖1B可以看出，隨著四丁基溴化銨濃度的增加，二者的保留都呈現(xiàn)出增加的趨勢。當(dāng)四丁基溴化銨濃度大于6 mmol/L時(shí)，利塞膦酸鈉保留增加趨于緩慢。同時(shí)四丁基溴化銨濃度的增加改善了利塞膦酸鈉峰形的拖尾，說明四丁基溴化銨也起到了減尾劑的作用?？紤]到利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸的保留行為和峰形情況，最終選擇四丁基溴化銨的濃度為6 mmol/L，在此條件下，二者分離良好，利塞膦酸鈉峰的拖尾因子為1.05。

（3）有機(jī)改性劑比例的影響。當(dāng)四丁基溴化銨的濃度（6 mmol/L）、磷酸二氫鈉緩沖液濃度（5 mmol/L）及流動相pH值（7.0）一定時(shí)，加入體積分?jǐn)?shù)為5%～25%的甲醇，考察其對利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸保留行為的影響，結(jié)果見圖1C。

圖1C結(jié)果表明，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，流動相的極性減小，洗脫能力增強(qiáng)，利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸的保留均減弱。兼顧到合適的保留時(shí)間與分離情況，最終選擇甲醇的體積分?jǐn)?shù)為20%。

（4）緩沖液濃度的影響。在6 mmol/L四丁基溴化銨及20%甲醇條件下，濃度為5～50 mmol/L的磷酸鹽（磷酸二氫鈉）緩沖液對利塞膦酸鈉和2-（3-吡啶）乙酸保留行為的影響見圖1D。

由圖1D可知，隨著磷酸鹽緩沖液濃度的增加，二者的保留均減弱。為了保證良好的分離及合適的保留時(shí)間，最終選擇磷酸鹽緩沖液的濃度為5 mmol/L。

在上述試驗(yàn)確定的優(yōu)化條件下，采用C8色譜柱，取利塞膦酸鈉對照品、2-（3-吡啶）乙酸對照品、注射用利塞膦酸鈉（批號：20110811）、利塞膦酸鈉注射液（批號：20120107）、經(jīng)氧化破壞的利塞膦酸鈉注射液樣品（批號：20120107）及經(jīng)紫外燈（40 W，照射6 d）照射后的利塞膦酸鈉注射液樣品（批號：20120107）水溶液進(jìn)樣，結(jié)果見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.利塞膦酸對照品；B.2-（3-吡啶）乙酸對照品；C.注射用利塞膦酸鈉；D.利塞膦酸鈉注射液；E.氧化破壞后的利塞膦酸鈉注射液；F.紫外照射后的利塞膦酸鈉注射液；a.利塞磷酸鈉；b.2-（3-吡啶）乙酸；c～e.其他氧化分解產(chǎn)物Fig 2 HPLC chromatogramsA.control of RS；B.control of 2-（3-pyridine）acetic acid；C.RS for injection；D.RS injection；E.injection samples destroyed by oxidation；F.injection samples after ultraviolet radiation；a.RS；b.2-（3-pyridine）acetic acid；c-e.other products of oxidation and decomposition

由圖2可見，2-（3-吡啶）乙酸和利塞膦酸鈉的保留時(shí)間分別約為3.0、7.8 min，9 min內(nèi)即可完成一次進(jìn)樣分析；且利塞膦酸鈉與有關(guān)化合物的分離情況良好，與保留時(shí)間最接近的雜質(zhì)峰的分離度大于2.5。

3 討論

雙膦酸類藥物（包括雙膦酸和雙膦酸鹽）是一類含有P-C-P鍵的化合物，含有2個(gè)膦酸基團(tuán)，因而極性很強(qiáng)，不能在C8、C18等非極性色譜柱上保留，其色譜分析方法多采用離子交換HPLC法[1-8]。雙膦酸類化合物是四元酸，存在多級電離，在離子交換HPLC法中為了保證其以單一的電離形式保留，需要采用強(qiáng)堿或強(qiáng)酸性流動相，因而這些方法大多以價(jià)格昂貴的耐強(qiáng)堿或耐強(qiáng)酸的陰離子交換柱為固定相；且需要梯度洗脫，分離效果及重現(xiàn)性差，操作煩瑣耗時(shí)，分析成本高，難以在藥品的常規(guī)分析中應(yīng)用。

本文建立的離子對RP-HPLC法，通過在流動相中加入離子對試劑四丁基溴化銨，使得利塞膦酸鈉及其有關(guān)物質(zhì)在反相色譜柱上保留，并通過優(yōu)化色譜條件，采用等度洗脫方式便達(dá)到了很好的分離及含量測定效果；且方法可靠、簡單，不需要復(fù)雜的樣品處理過程，故適用于利塞膦酸鈉原料藥及其制劑的常規(guī)檢驗(yàn)。

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