張樂，周世文，徐穎，應(yīng)懿，黃永平，湯建林（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院臨床藥理基地，重慶400037）

坎地沙坦酯是一種血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體AT1亞型拮抗藥，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與氯沙坦、伊貝沙坦相似，同屬二苯四咪唑類。它可選擇性地阻滯由AT1受體所介導(dǎo)的AngⅡ功能（如血管收縮和醛固酮分泌），從而發(fā)揮降壓作用。其與AT1受體的親和力是AT2受體的10000倍，具有親和力強(qiáng)和解離慢的特點(diǎn)。臨床研究表明，每日給予高血壓患者本品4～16 mg，其降壓作用呈劑量依賴性，降壓效果優(yōu)于氯沙坦50 mg。坎地沙坦酯口服后迅速從胃腸道吸收，并水解成具有活性的代謝產(chǎn)物坎地沙坦產(chǎn)生血管收縮對抗作用。食物對本品吸收沒有影響，重復(fù)給藥無蓄積作用。由于坎地沙坦酯血漿中藥物含量低且內(nèi)源性物質(zhì)干擾大，采用常規(guī)的高效液相色譜（HPLC）-紫外測方法難以達(dá)到所需的檢測靈敏度[1]。本試驗(yàn)根據(jù)藥物的理化性質(zhì)及國內(nèi)外文獻(xiàn)[1]，設(shè)計(jì)建立了高效液相色譜-熒光法，用于坎地沙坦的測定，并對坎地沙坦酯制劑進(jìn)行人體生物等效性研究。

1 材料

1.1 儀器

Waters-600 E型高效液相色譜系統(tǒng)，配2475型熒光檢測器，717 plus型自動(dòng)進(jìn)樣器及Millennium32色譜管理軟件（美國Waters公司）；MC-210 S型電子天平（精度0.01 mg，德國Sartorius公司）；高速離心機(jī)（美國Abbott公司）；Millipore超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

受試制劑（T）：坎地沙坦酯膠囊（重慶市西曦藥物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)，每粒含坎地沙坦酯4 mg，批號：061001）；參比制劑（R）：坎地沙坦酯片（商品名：必洛斯，日本武田藥品工業(yè)株式會社生產(chǎn)，重慶市西曦藥物技術(shù)開發(fā)有限公司提供，每片含坎地沙坦酯8 mg，批號：060601）；坎地沙坦對照品（重慶圣華曦制藥有限公司，純度：99.5%）；內(nèi)標(biāo)：纈沙坦對照品（重慶圣華曦制藥有限公司，純度：99.0%）；三乙胺（德國Fluka公司，純度≥99.5%）；乙醚、甲醇均為色譜純，磷酸等其他試劑均為分析純，試驗(yàn)用水均為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；保護(hù)柱：C18柱芯（4.0 mm×3.0 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（66∶34，V/V，磷酸調(diào)pH至4.0）；流速：1 ml/min；激發(fā)波長：265 nm，發(fā)射波長：395 nm；柱溫：30℃。在選定的色譜條件下，分別考察了7個(gè)不同來源的空白血漿、空白血漿+對照品及實(shí)測樣品的色譜分離情況。結(jié)果表明，被測物、內(nèi)標(biāo)與血漿內(nèi)源性雜質(zhì)分離完全，無干擾?？驳厣程购蛢?nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間分別為5.9、8.9 min。測得坎地沙坦色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.2.1 坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取坎地沙坦對照品5.38 mg于50 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為107.6 μg/ml的對照品貯備液，于4℃避光保存。臨用前，精密吸取該貯備液4 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配成43.04μg/ml的坎地沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃避光保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取纈沙坦對照品5.13 mg于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為51.3 μg/ml的內(nèi)標(biāo)貯備液，4℃保存。臨用前，取內(nèi)標(biāo)貯備液1 ml于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成5.13 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液備用。

2.3 血漿樣品預(yù)處理

取血漿1 ml加入內(nèi)標(biāo)溶液（5.13 μg/ml纈沙坦）50 μl，混合均勻后，加入1 mol/L鹽酸200 μl，渦旋混合3 min，加入乙醚5 ml提取，完全旋渦，3000 r/min離心10 min，取乙醚層置于另一試管中，37℃氮?dú)獯蹈?，殘留物加入流?dòng)相300 μl溶解，旋渦混合1 min，4000 r/min離心20 min，取上清液100 μl進(jìn)樣。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿1 ml依次加入內(nèi)標(biāo)溶液（5.13 μg/ml纈沙坦）50 μl和不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl，配制成相當(dāng)于坎地沙坦血漿質(zhì)量濃度為 0.98、1.95、3.91、7.81、15.62、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 ng/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品。按“2.3”項(xiàng)下依法操作，每一濃度進(jìn)樣100 μl，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝－6.32×10－3x+1.03×10－2（r＝0.9997）。說明坎地沙坦血藥濃度在0.98～500.00 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。血漿中坎地沙坦定量下限為0.98 ng/m（l信噪比為5，x ＝1.11 ng/ml，RSD＝11.5%，n＝5）。

2.5 精密度試驗(yàn)

取空白血漿1 ml，按“2.4”項(xiàng)下方法配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下依法操作，于同一天不同時(shí)間段測定，考察日內(nèi)精密度。3個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品各5份，連續(xù)測定3 d，考察日間精密度，結(jié)果見表1。

2.6 回收率試驗(yàn)

表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.6.1 相對回收率：取空白血漿1 ml，按“2.4”項(xiàng)下的方法制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（坎地沙坦血漿濃度分別為1.95、31.25、250 ng/ml）的樣品各5份并依法測定。將藥物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得藥物濃度，其與實(shí)際藥物濃度的比值即為相對回收率，結(jié)果見表1。

2.6.2 絕對回收率：取空白血漿1 ml，按“2.4”項(xiàng)下的方法制備低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（坎地沙坦血漿濃度分別為1.95、31.25、250 ng/ml）的樣品各5份并依法測定。以提取后待測物色譜峰面積與相同濃度未經(jīng)提取直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積之比，計(jì)算樣品的絕對回收率，結(jié)果見表1。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

本試驗(yàn)考察了未經(jīng)處理的坎地沙坦血漿樣品室溫放置24 h，－20℃冷凍放置21 d及凍融3次的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of stability test

2.8 血樣采集

根據(jù)國家藥品監(jiān)督管理局新藥臨床研究批件（2003 L00047），經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)，20名健康男性受試者在知情情況下填寫知情同意書，并實(shí)施試驗(yàn)。20名健康受試者口服8 mg受試制劑或參比制劑后，分別采集服藥前及服藥后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36 h時(shí)的靜脈血約4 ml肝素抗凝，分離得到血漿于，－20℃冰箱保存，待測血藥濃度。

2.9 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

用BECS軟件程序?qū)?jīng)對數(shù)換后的AUC0-t、AUC0-∞、cmax和實(shí)測tmax進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。方差分析后進(jìn)行雙單側(cè)t檢驗(yàn)及90%的可信限判斷，坎地沙坦酯膠囊經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后AUC0-t、AUC0-∞的90%可信限分別落在參比制劑的80.4%～107.3%和80.2%～107.0%范圍內(nèi)。經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后cmax的90%可信限落在參比制劑的80.1%～111.6%范圍內(nèi)。tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)無顯著性差異。由此判斷2種制劑生物等效。20名受試者單劑量口服8 mg受試制劑或參比制劑后的平均藥-時(shí)曲線見圖2。

圖2 20名健康受試者分別口服受試制劑和參比制劑后坎地沙坦藥-時(shí)曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curves in 20healthy volunteers of test and reference candesartan preparations

3 討論

在摸索流動(dòng)相體系的過程中，我們考察了流動(dòng)相中甲醇的不同體積分?jǐn)?shù)（70%、66%、60%）及流動(dòng)相的不同pH值（5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5）對分析結(jié)果的影響，通過比較，選擇本流動(dòng)相效果最佳。在此條件下，雜質(zhì)峰對樣品峰干擾小，保留時(shí)間適宜，坎地沙坦和內(nèi)標(biāo)纈沙坦保留時(shí)間分別為5.9 min和8.9 min，與文獻(xiàn)報(bào)道相比均有所提前，既節(jié)省進(jìn)樣時(shí)間又節(jié)省試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。樣品處理時(shí)考慮到操作的方便性，采用鹽酸沉淀蛋白后直接用乙醚提取，坎地沙坦提取回收率較高，且不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，同時(shí)還提高了測定靈敏度，定量下限為0.98ng/ml。試驗(yàn)結(jié)果表明，本法可用于該藥的血漿含量測定及制劑的生物等效性研究。

[1]Stenhoff H，Per-Olof lagerstr?m，Andersen C.Determination of candesartan cilexetil，candesartan and a metabolite in human plasma and urine by liquid chromatography and fluorometric detection[J].Journal of Chromatography B，1999，731（9）：411.