(河北省石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心,河北石家莊 050041)
犢牛腹瀉病是世界范圍內(nèi)犢牛的常發(fā)病,給養(yǎng)牛業(yè)帶來很大損失。以往細菌性犢牛腹瀉治療主要用抗生素,見效快,但細菌產(chǎn)生耐藥性,也可能出現(xiàn)獸藥殘留等。鑒于中草藥具有毒副作用小的優(yōu)勢,開發(fā)高效、新型中藥制劑,勢在必行。
①賽多利斯電子分析天平,型號:BS210S,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司制造;②高頻數(shù)控超聲波清洗器,型號:KQ-250TDV,昆山市超聲儀器有限公司制造;③旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,型號:R205,上海申勝生物技術(shù)有限公司制造。
①試驗用黃連、烏梅、白術(shù)、木香、甘草、黃芪及番瀉葉均購于黑龍江省中藥材批發(fā)市場。②乙醚(分析純),批號:20111014(天津市福晨化學試劑廠);硫酸阿托品注射液,批號:1007091(天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司);醋酸地塞米松片,批號:100413(天津藥業(yè)集團有限公司;98%乙醇。
昆明小鼠,體重18~22 g,雌雄各半,購自河北醫(yī)科大學。
①取木香10 g、白術(shù)10 g、甘草10 g、黃芪15 g,加8倍量的蒸餾水,用超聲法提取,提2次,每次1 h。過濾:濾液用70%乙醇進行醇沉、過濾,濾液回流除醇、濃縮。②取烏梅15 g、黃連40 g,加8倍量的60%乙醇,用超聲法提取,提2次,每次1 h。過濾,濾液回流除醇、濃縮。③最后將上述提取液合并,濃縮成1 g/ml(即1 ml藥液含有1 g生藥)、2 g/ml(即1 ml藥液含有2 g生藥)、3 g/ml(即1 ml藥液含有3 g生藥)3個濃度梯度,作為藥量高、中、低3個劑量組。
取番瀉葉干燥葉片,加沸騰的蒸餾水調(diào)和,再加冷蒸餾水配成8%的混懸液,不必久煮,過濾即得。
2.3.1 對正常小鼠胃腸蠕動的影響[1]
取50只體重在18~22 g的昆明種小鼠,雌雄各半,隨機分為5組,每組10只,分別為高、中、低藥物組、空白對照組、阿托品組。飼養(yǎng)觀察1~2 d,有腹瀉的小鼠淘汰。試驗前禁食24h,不禁水。試驗時,每只小鼠按0.1~0.2 ml/10g·bw的劑量灌服對應組藥物,空白對照組灌服等量的生理鹽水,0.5 h后每只小鼠灌服5%墨水0.3 ml。0.5 h后頸椎脫臼處死小鼠,打開腹腔分離腸系膜,剪取上端至幽門、下端至回盲部的腸管,放在托盤中。輕輕將小腸擺成直線,測量腸管長度作為“小腸總長度”。從幽門至墨汁前沿的距離作為“墨汁在腸內(nèi)推進距離”。用公式計算墨汁推進百分率。
2.3.2 對番瀉葉所致小鼠腹瀉的影響
取50只昆明種小鼠,體重18~22g,雌雄各半,隨機分為5組,每組10只,分別為高、中、低藥物組、模型對照組、阿托品組。試驗前先飼養(yǎng)觀察1~2d,有腹瀉的小鼠淘汰。試驗前禁食12 h,試驗時,小鼠按0.2 ml/10 g·bw的劑量灌服對應組藥物,模型對照組灌服等量的生理鹽水,0.5 h后,小鼠按0.25 ml/10g·bw的劑量灌服8%番瀉葉混懸液,灌服完畢將小鼠單個放在墊有報紙的鼠籠內(nèi),觀察腹瀉情況。小鼠每腹瀉1次換1次墊紙,每隔1 h累積計算小鼠稀便率及稀便級,連續(xù)觀察5 h。按公式計算腹瀉指數(shù)。
腹瀉指數(shù)=稀便率(每只動物所排稀便數(shù)與總便數(shù)之比)×稀便級(以稀便污染濾紙形成污跡面積的大小定級,分為4級:1級為污染直徑小于1cm;2級污染直徑1~1.9 cm;3級污染直徑2~3 cm;4級污染直徑大于3 cm)。
統(tǒng)計時先逐個統(tǒng)計每1堆稀便的級數(shù),然后將該鼠所有稀便級數(shù)相加除以稀便次數(shù),得到稀便的平均級數(shù)為稀便級。
級數(shù)直徑的測量:糞便形狀為圓形,則直接量直徑;若糞便形狀為橢圓形則測量橢圓長軸和短軸的長度,相加除以2為糞便直徑。
觀察時間:給藥后的5 h內(nèi)。
干便與稀便的區(qū)分:以濾紙上有無污跡為標準。糞便次數(shù)以每?;蛎慷眩ú荒芊智辶?shù)者)為1次。
試驗數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件及Excel數(shù)據(jù)處理工具進行數(shù)據(jù)分析處理,以平均值()±標準差(s)表示。
抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液高、中、低劑量組和阿托品組對小鼠正常胃腸蠕動均有抑制作用,抑制率分別為15.8%、12.0%、7.3%和22.2%。
抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液高、中、低劑量組和阿托品組與空白對照組相比較,差異極顯著(p<0.01);抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液高、中、低劑量組與阿托品組相比較,差異極顯著(p<0.01)。結(jié)果詳見表1。
表1 抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液對正常小鼠胃腸蠕動的影響(±s,n =10)
表1 抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液對正常小鼠胃腸蠕動的影響(±s,n =10)
a 與空白對照組比較:**p<0.01b 與阿托品組比較:##p<0.01
組別 動物數(shù)(只) 推進率(%) 抑制率(%)空白對照組 10 80.18±3.61 -阿托品組 10 62.34±2.98** 22.2低劑量組 10 74.34±2.56** ## 7.3中劑量組 10 70.56±3.76** ## 12.0高劑量組 10 67.49±4.27** ## 15.8
抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液高、中、低劑量組及阿托品組在2h內(nèi)的腹瀉指數(shù)與模型對照組相比較,差異極顯著(p<0.01),低劑量組與阿托品組比較,差異顯著(p<0.05);3 h內(nèi)阿托品組和中劑量組腹瀉指數(shù)與模型對照組比較,差異極顯著(p<0.01),高劑量組和低劑量組與模型對照組比較差異顯著(p<0.05)。結(jié)果詳見表2。
表2 抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液對番瀉葉所致小鼠腹瀉的影響( ±s,n =10)
表2 抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液對番瀉葉所致小鼠腹瀉的影響( ±s,n =10)
a 2h內(nèi)與模型對照組比較:**p<0.01;與阿托品組比較:#p<0.05b 3h內(nèi)與模型對照組比較:**p<0.01,*p<0.05
腹瀉指數(shù)1h 2h 3h 4h 5h模型對照組 10 0.61±0.70組別 動物數(shù)(只)0.76±0.39阿托品組 10 0.23±0.42 2.05±0.65 1.87±0.66 1.04±0.42 0.65±0.46低劑量組 10 0.54±0.52 0.65±0.50**0.99±0.49**0.88±0.46 0.74±0.34中劑量組 10 0.30±0.48 1.24±0.56**#1.26±0.44*0.93±0.47 0.61±0.29高劑量組 10 0.23±0.32 0.91±0.45**1.09±0.41**0.91±0.38 0.60±0.33 0.70±0.56**1.11±0.52*0.83±0.47
本試驗通過抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液對胃腸蠕動的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液高、中、低劑量組對胃腸蠕動均有明顯抑制作用(p<0.01)與空白對照組相比,抑制率分別為15.8%、12.0%和7.3%。
本試驗通過給小鼠灌服番瀉葉混懸液造成急性腹瀉。在給藥1~5h內(nèi)觀察小鼠的腹瀉指數(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠腹瀉指數(shù)在2h內(nèi)達到最高,隨后逐漸降低,這可能是因為動物在經(jīng)過12 h的禁食之后,排便高峰期主要在造模后2 h以內(nèi),隨后排便的次數(shù)和數(shù)量都減少了??辜毦誀倥8篂a中藥顆粒劑原料藥復方提取液高、中、低劑量組在2h內(nèi)腹瀉指數(shù)與模型對照組相比差異極顯著(p<0.01),3h內(nèi)差異顯著(p<0.01,p<0.05),1h、4h、5h內(nèi)無差異。
本試驗中導致試驗性腹瀉的番瀉葉是刺激大腸性致瀉劑[2],番瀉葉所含蒽甙在大腸內(nèi)細菌酶的作用下還原成蒽酮(或蒽酚),后者刺激腸粘膜并能抑制鈉離子從腸腔向腸粘膜上皮細胞的轉(zhuǎn)運,使大腸內(nèi)水分增加、蠕動亢進而致腹瀉[3]。
綜上所述,抗細菌性犢牛腹瀉中藥顆粒劑原料藥復方提取液有明顯抑制胃腸蠕動和抗腹瀉的作用,且隨劑量增加其作用加強。但其具體抑制胃腸蠕動和抗腹瀉的作用機制是抑制膽堿能神經(jīng)、5-HT神經(jīng)興奮及遞質(zhì)釋放;抑制內(nèi)源性、外源性刺激誘導的肌漿網(wǎng)鈣離子釋放,降低平滑肌細胞內(nèi)鈣離子水平,促進腸管舒張;抑制胃腸平滑肌上的H1受體興奮還是促進腸道對水、鈉的吸收,降低腸內(nèi)壓,維持腸道內(nèi)水、電解質(zhì)的平衡,起到緩瀉有必要做進一步的研究討論。
[1] 徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.
[2]張明發(fā).小檗堿的抗腹瀉和抗炎作用[J].中國藥理學報.1989,10(2):174-176.
[3]陳正倫.獸醫(yī)中藥藥理學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995.