邵陽(yáng)光，劉姣，李豐

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110001）

組蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases，HDACs）是真核細(xì)胞中的一類重要蛋白酶，參與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用［1］。通過(guò)組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors，HDACis） 抑制 HDACs 的作用可使癌細(xì)胞凋亡，腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)改變［2］。目前，HDACs已經(jīng)成為癌癥治療的靶點(diǎn)［3］。人HDACs分為3類：I類與酵母Rpd3同源，包括HDAC1-3、8、11；Ⅱ類與酵母 Hdal同源，包括 HDAC4-7、9、10；Ⅲ類與酵母Sir2同源，包括SIRT1-7。HDAC4可在核質(zhì)之間穿梭，與多種蛋白相互作用，參與結(jié)腸癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)生［4，5］、神經(jīng)元的存亡［6］，且與神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關(guān)［7］，然而其確切作用機(jī)制尚未明確。本研究利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建人HDAC4的原核表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定，為進(jìn)一步研究HDAC4的蛋白質(zhì)相互作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α感受態(tài)和BL21感受態(tài)為本實(shí)驗(yàn)室制備；pGEX-5X-1購(gòu)自 Invitrogen公司。人pcDNA3.1-HDAC4質(zhì)粒由美國(guó)佛羅里達(dá)H.Lee莫菲特癌癥研究中心E.Seto博士惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司，限制性內(nèi)切酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TaKaRa公司，去磷酸化酶及T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pharmacia公司，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自MBI公司，異丙基硫代-β-D 半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）購(gòu)自 Amresco公司，anti-GST 抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自GE Healthcare，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 pGEX-5X-1-HDAC4原核表達(dá)載體的構(gòu)建

pcDNA3.1-HDAC4經(jīng)EcoRⅠ單酶切后，凝膠回收純化獲得HDAC4產(chǎn)物。EcoRⅠ單酶切pGEX-5X-1載體，凝膠回收后去磷酸化，再回收。將純化后的載體和片段用T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接后，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落于LB（Amp）中37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切鑒定片段的插入，SalⅠ酶切鑒定插入的方向。選擇正確插入的克隆送金斯瑞公司測(cè)序。

1.4 GST-HDAC4誘導(dǎo)表達(dá)及純化

pGEX-5X-1和pGEX-5X-1-HDAC4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21后，于1 mL的LB（Amp）37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1︰100稀釋菌液，37℃擴(kuò)培至OD600為0.6時(shí)，不同濃度的IPTG28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。4℃離心收集菌體沉淀，裂解后進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。將過(guò)夜培養(yǎng)的BL21按1︰1000稀釋擴(kuò)培，IPTG28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。離心收集菌體并裂解后，加入30 μL50%的 Glutathione Sepharose 4B，4℃孵育3 h，用NP-40緩沖液清洗后加入50 μL50%的Glutathione Sepharose 4B，取10 μL 進(jìn)行 SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色觀察。

1.5 Western blot鑒定GST-HDAC4融合蛋白的表達(dá)

將上述誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白進(jìn)行8%SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，anti-GST抗體（Cell Signaling公司，1︰1000）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜15 min、3次后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1︰5000）室溫孵育2 h，TBST洗膜15 min、3次，ECL 顯影。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-5X-1-HDAC4原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

將重組質(zhì)粒pGEX-5X-1-HDAC4經(jīng)EcoRI單酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察到3260 bp的插入片段（圖1）。為了鑒定所插入HDAC4全長(zhǎng)的方向，將重組質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果獲得7560 bp和664 bp2條帶的為反向，獲得5 636 bp和2588 bp2條帶的為正向，只有1條4 900 bp帶的為載體的自身環(huán)化（圖2）。正向陽(yáng)性重組子測(cè)序鑒定正確，無(wú)移碼突變。

2.2 GST-HDAC4的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化

pGEX-5X-1及pGEX-5X-1-HDAC4轉(zhuǎn)化BL21后IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后考馬斯亮藍(lán)染色觀察誘導(dǎo)條帶，與未誘導(dǎo)組相比，重組質(zhì)粒在146 kDa的位置上出現(xiàn)1條明顯的特異性蛋白帶（圖3）。將已純化好的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色觀察，結(jié)果如圖4所示，空心五角星表示融合蛋白的條帶。

2.3 融合蛋白的Western blot鑒定

用anti-GST抗體對(duì)GST-HDAC4融合蛋白的表達(dá)進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果顯示：在分子量為120 kDa上方出現(xiàn)1個(gè)特異性條帶（圖5），分子量約為146 kDa，為質(zhì)粒本身的GST分子量（26 kDa）和HDAC4分子量（120 kDa）之和，說(shuō)明表達(dá)了融合蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致。

3 討論

核小體是真核生物染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，組蛋白是核小體的重要組成部分。組蛋白可以發(fā)生多種共價(jià)修飾，其中乙?；亲钤绫话l(fā)現(xiàn)且與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的組蛋白修飾方式。它是一種可逆的動(dòng)態(tài)過(guò)程，由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）和HDACs共同調(diào)控。HATs使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄；HDACs可使組蛋白去乙?；旧|(zhì)致密卷曲，抑制轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙酰化水平的異常在各種癌癥的發(fā)生、發(fā)展、增殖和分化中起重要作用，研究HDACs對(duì)于進(jìn)一步了解這些疾病的分子機(jī)制也有著重要的提示意義［8，9］。HDAC4是Ⅱ類HDACs成員之一，與Ⅰ類HDACs無(wú)論在結(jié)構(gòu)上還是功能上都有很大差異。在結(jié)構(gòu)上，HDAC4除了C端的催化結(jié)構(gòu)域外，還含有1個(gè)Ⅱ類特有的N端結(jié)構(gòu)域。功能上，HDAC4能夠在核質(zhì)之間穿梭是區(qū)別于Ⅰ類的最大特征。HDAC4是分化和發(fā)育過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其功能的異常與多種癌癥的發(fā)生相關(guān)，因此深入研究HDAC4的功能及其調(diào)控具有重要意義。本研究成功構(gòu)建了人HDAC4的原核表達(dá)質(zhì)粒，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化和鑒定，為深入研究HDAC4與蛋白質(zhì)的相互作用及其生物學(xué)意義奠定了基礎(chǔ)。

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