侯偉健，佟浩，柏樹令，陳慶和，田曉紅，張保功

（中國醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織工程學(xué)教研室；2.實(shí)驗(yàn)設(shè)備處；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，沈陽110001）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是由于圍產(chǎn)期供血閉塞、窒息缺氧導(dǎo)致胎兒或新生兒腦的缺氧缺血性損傷。該病對(duì)患兒腦發(fā)育可造成嚴(yán)重的影響，產(chǎn)生一系列神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。HIE的死亡率高，存活者常有輕重不一的神經(jīng)后遺癥。因此，HIE被認(rèn)為是兒童神經(jīng)傷殘的重要病因之一。國內(nèi)外研究者［1，2］對(duì)HIE的致病機(jī)制和治療方法進(jìn)行了長期、細(xì)致的研究，積累了一定的經(jīng)驗(yàn)并取得了較大的進(jìn)展，但仍有較多的問題需進(jìn)行深入研究。在缺氧缺血性腦損傷的致病和再生機(jī)制的研究中，適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型是不可缺少的。目前最為常用的經(jīng)典動(dòng)物模型是參照 Rice等［3］于1981年制作的新生大鼠缺氧缺血腦損傷（hypoxia and ischemia brain damages，HIBD）模型，對(duì)新生 7 d大鼠手術(shù)結(jié)扎單側(cè)頸總動(dòng)脈并經(jīng)低濃度氧（8%）處理數(shù)小時(shí)，?？傻玫捷^好的缺氧缺血效果，適于進(jìn)行較長時(shí)程的大腦神經(jīng)病理與功能損害的研究。該制作過程主要由手術(shù)和術(shù)后低氧處理兩大部分組成，二者缺一不可。用該方法制作動(dòng)物模型，手術(shù)部分比較容易實(shí)現(xiàn)，但穩(wěn)定可靠的低氧處理?xiàng)l件則是一個(gè)需要解決的重要問題。不同的研究者基于各自的條件采用不同的方法進(jìn)行低氧處理，得到了相應(yīng)的處理結(jié)果［4，5］。本實(shí)驗(yàn)室不具有此種低氧處理?xiàng)l件，我們根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)CO2孵箱的原理并參考國外的專用設(shè)備，自行購買相應(yīng)的組（配）件，組建了可以人為設(shè)置并由儀器自動(dòng)調(diào)節(jié)控制氧濃度的動(dòng)物低氧處理箱，并利用其進(jìn)行新生大鼠缺氧缺血模型的制作，得到了較好的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

新生7 d齡SD大鼠（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部），KY-2F型控氧儀及氧濃度檢測探頭（浙江省建德市梅城電化儀器廠），透明有機(jī)玻璃密閉箱（50 cm×40 cm×40 cm，中國醫(yī)科大學(xué)解剖技術(shù)室制做），電磁感應(yīng)開關(guān)（QIANJI RELAY Co.LTD），電磁閥（國產(chǎn)），高壓氮?dú)猓ㄉ蜿栣t(yī)用氣體廠），超低溫冰箱（-80℃，SANYO，MDF-U32V），細(xì)胞超聲破碎儀（美國Sonics&Materials公司，Model：Vcx130），低溫高速離心機(jī)（SIGMA1-15k，德國），Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），酶標(biāo)儀（Bio-Rad Model 680），HIF-1α抗體（北京博奧森生物技術(shù)公司），Cofilin和 p-Cofilin抗體、LIMK 抗體、Erk及p-Erk抗體（美國Santa Cluz公司），HRP-標(biāo)記羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)公司），化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），醫(yī)用X線感光膠片（Kodak公司，廈門醫(yī)用膠片廠），免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 低氧箱自動(dòng)氧濃度控制系統(tǒng)的組建與調(diào)試：利用自制的透明有機(jī)玻璃密閉箱，連接購買的KY-2F型控氧儀，同時(shí)在控氧儀的信號(hào)輸出端連接電磁感應(yīng)開關(guān)，電磁感應(yīng)開關(guān)之后連接電磁閥門，氮?dú)夤苈吠ㄟ^此電磁閥門進(jìn)入密閉箱。

調(diào)試使用及工作原理：連接控氧儀電源線，安裝氧濃度檢測探頭，打開儀器電源主開關(guān)。儀器首先初始化并與大氣中氧平衡，調(diào)整儀器微調(diào)旋鈕使顯示為21.0%，設(shè)置控氧范圍上限為9.9%。打開氮?dú)馄靠傞y，再打開減壓表閥門，使氮?dú)馔ㄟ^管道進(jìn)入密閉箱。隨著氮?dú)獾倪M(jìn)入，密閉箱中的氧氣濃度逐漸降低，氧檢測探頭將檢測信號(hào)送入控氧儀，并通過儀器的輸出端，將氧濃度信號(hào)送入電磁感應(yīng)開關(guān)，由感應(yīng)開關(guān)的動(dòng)作控制器下方的電磁閥門開關(guān)。當(dāng)儀器檢測的氧濃度值高于設(shè)定值時(shí)，感應(yīng)開關(guān)打開，電磁閥門打開，氣體進(jìn)入密閉箱；而當(dāng)儀器檢測密閉箱中的氧濃度低于設(shè)定值（9.9%）時(shí)，感應(yīng)開關(guān)關(guān)閉，并控制電磁閥門關(guān)閉，此時(shí)氮?dú)馔Ｖ惯M(jìn)入密閉箱。在電磁閥門關(guān)閉后的一段時(shí)間內(nèi)，密閉箱中的氧濃度仍有一段慣性降低，一般可繼續(xù)降低1.0%～2.0%（隨通入氮?dú)獾乃俣榷煌?，?shí)際值可達(dá)7.5%～8.5%。隨后改調(diào)儀器的控制上限值（8.5%）和氣體通入速度，可使密閉箱中的氧濃度值基本穩(wěn)定于8.0%～8.5%范圍內(nèi)。一旦氣體流量和設(shè)置上限調(diào)節(jié)完畢，整個(gè)系統(tǒng)即可自動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)維持密閉箱中氧濃度的恒定。

1.2.2 HIBD模型手術(shù)：取7 d齡新生大鼠，體質(zhì)量10～14 g，分為手術(shù)組與假手術(shù)組，2%水合氯醛腹腔注射麻醉（10 mL/kg）后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，于動(dòng)脈下方穿入手術(shù)線雙點(diǎn)結(jié)扎，并于雙結(jié)扎點(diǎn)中間剪斷血管，縫合切口。動(dòng)物術(shù)后放于35℃溫箱中復(fù)蘇2～4 h后，將手術(shù)組動(dòng)物放入缺氧密閉箱中低氧（8.0%～8.5%）處理2～2.5 h，然后放入母鼠籠中，由母鼠繼續(xù)喂養(yǎng)。術(shù)后動(dòng)物按1h，12 h，24 h，48 h，72 h，7 d，14 d，21 d 分組處死取腦組織，于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆没蛴?%多聚甲醛灌流固定以備進(jìn)行免疫組化檢測。

1.2.3 Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)與損傷相關(guān)的信號(hào)蛋白表達(dá)：取各處理組大鼠大腦皮層組織1～2 mg，加入RIPA裂解液（含100 μmol/L PMSF），冰上裂解30 min，0～4℃下超聲粉碎。利用Bradford法測定蛋白濃度，計(jì)算后用5×蛋白上樣緩沖液（loading buffer）調(diào)整至50 μg/樣品，加熱100 ℃處理5 min。（1）配膠：分離膠濃度11.5%，濃縮膠濃度4%，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電壓70～110V，電泳時(shí)間約100 min。經(jīng)電轉(zhuǎn)移將電泳分離膠中蛋白區(qū)帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜，電壓100 V，時(shí)間2 h。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用5%脫脂奶粉-TBST溶液封閉1 h；（2）多克隆一抗 ：HIF-1α、LIMK、cofilin、p-Cofilin、Erk、p-Erk 及 內(nèi)參β-actin按適當(dāng)稀釋度稀釋后與膜的適當(dāng)位置孵育4℃過夜，TBST溶液洗5 min×4；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗5 min×4；暗室中用化學(xué)發(fā)光試劑顯跡，X線膠片感光記錄。

1.2.4 免疫組化法檢測特定蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)：模型動(dòng)物經(jīng)心臟灌流，用生理鹽水沖出血液，然后灌注4%多聚甲醛（溶于0.1 mol/L PBS）約100 mL，至四肢抽搐變硬，取出腦組織，浸泡于4%多聚甲醛固定。數(shù)日后經(jīng)石蠟包埋切片，切片脫蠟和水化后，PBS沖洗3次，加1滴過氧化物酶阻斷溶液，室溫孵育10 min，PBS沖洗后，加1滴小牛血清及50 μL Cofilin或 p-Cofilin一抗（Santa Cruze），室溫下孵育60 min，PBS沖洗后，加生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫孵育10 min，然后依次加入鏈霉卵白素—過氧化物酶溶液及DAB酶底物顯色劑等，光鏡下觀察3～10 min后，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 密閉低氧動(dòng)物實(shí)驗(yàn)箱氧控系統(tǒng)在缺氧缺血?jiǎng)游锬Ｐ吞幚碇械淖詣?dòng)控制效果

氮?dú)馄?、低氧密閉箱、氧感應(yīng)探頭和控氧儀及其他控制開關(guān)和閥門連接安裝后，放入頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)后的幼大鼠，關(guān)閉密閉箱蓋，儀器先與大氣氧平衡，校準(zhǔn)儀器顯示氧濃度為21%，然后開始通入氮?dú)狻ｋS著氮?dú)獾妮斎?，儀器測量的氧濃度值逐漸降低，至設(shè)定的上限值時(shí)電磁閥門自動(dòng)關(guān)閉。此后一段時(shí)間氮?dú)馔Ｖ馆斎?，密閉箱內(nèi)的氧濃度維持在設(shè)定范圍內(nèi)，當(dāng)密閉箱內(nèi)氧濃度再度升高超過設(shè)定上限值時(shí)，電磁閥門再次自動(dòng)開啟，氮?dú)廨斎?，氧濃度再度降低。如此維持密閉箱中的氧濃度基本穩(wěn)定在設(shè)定范圍內(nèi)。

2.2 大鼠缺血術(shù)后低氧處理腦損傷直觀效果

缺氧缺血處理后1，3，7，14 d取腦組織標(biāo)本觀察腦損傷直觀效果并留樣待測。部分標(biāo)本缺氧缺血損傷效果明顯，肉眼可見明顯缺血缺氧損傷灶，左腦后側(cè)部皮質(zhì)明顯蒼白或皮質(zhì)組織液化或塌陷（圖1）。

2.3 Western blot檢測 HIF-α、LIMK、Cofilin 及 ERk等蛋白的表達(dá)

結(jié)果可見，在缺氧缺血后不同的時(shí)間段，大腦皮質(zhì)細(xì)胞中蛋白表達(dá)及化學(xué)修飾發(fā)生不同的改變（圖2）。

2.4 缺氧缺血后不同時(shí)間大鼠腦免疫組化表達(dá)

結(jié)果顯示，用Cofilin和p-Cofilin抗體孵育雜交，可見不同處理對(duì)大鼠腦海馬細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響，缺氧缺血后損傷腦組織p-Cofilin明顯比對(duì)照組增強(qiáng)，也比相同實(shí)驗(yàn)組的Cofilin表達(dá)明顯增強(qiáng)。見圖3。

3 討論

在新生兒發(fā)育期，腦組織代謝非常旺盛，氧耗量最大，對(duì)缺氧極其敏感，易造成缺氧性損傷［6］。圍產(chǎn)期的缺氧缺血性腦損傷常由于血液供應(yīng)障礙（同時(shí)缺氧）引起。在缺血缺氧性腦損傷動(dòng)物模型的制作過程中，頸總動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)較易實(shí)現(xiàn)，而缺氧條件的實(shí)現(xiàn)則有一定的困難，其中氧濃度的測控則成為一個(gè)重要的限制因素。目前一些實(shí)驗(yàn)室采用從醫(yī)用氣體廠購買事先按比例混合好的O2（8%）和N2（92%）混合氣體，使用時(shí)直接將混合氣體通入一個(gè)密閉容器中［4，5，7］。此種方法操作容易，但無法實(shí)時(shí)測知密閉箱中的確切氧濃度及其變化，無法隨時(shí)調(diào)控氧的濃度，實(shí)際氧濃度值往往高于預(yù)期（8%）。

本實(shí)驗(yàn)借鑒了國外同類設(shè)備的調(diào)控機(jī)制，利用反饋調(diào)節(jié)的原理，采用簡單而經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法和配件，自行組配了可以自動(dòng)調(diào)節(jié)氧濃度的低氧動(dòng)物處理箱。經(jīng)過數(shù)十次實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其使用的可行性和可靠性。用該低氧箱制作的動(dòng)物缺氧缺血模型，從腦組織形態(tài)到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)和修飾及免疫組化等方面，都可獲得明顯的改變。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，在損傷較輕時(shí)，基本無異?？梢娀蚵杂心[脹；當(dāng)損傷加重時(shí)可見左腦組織變蒼白；當(dāng)損傷進(jìn)一步加重時(shí)，則可見左腦皮質(zhì)甚至海馬出現(xiàn)液化壞死，腦組織損傷現(xiàn)象與文獻(xiàn)報(bào)道相似［7，8］。從腦組織明顯損傷的情況看，本低氧處理箱的作用與缺血手術(shù)的聯(lián)合作用是明顯的。

從Western blot結(jié)果上看，缺氧缺血側(cè)的腦組織細(xì)胞中某些分子表達(dá)和修飾狀態(tài)也發(fā)生了明顯改變。HIF-1α的表達(dá)在缺氧缺血誘導(dǎo)后隨時(shí)間增加而逐漸增高，72 h后又逐漸降低。HIF-1α是由低氧誘導(dǎo)的，在缺氧狀態(tài)下HIF-1α的表達(dá)被誘導(dǎo)升高，進(jìn)而激活紅細(xì)胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、糖酵解酶等多種基因的轉(zhuǎn)錄，可提高機(jī)體對(duì)缺氧缺血的耐受［9］。缺氧缺血也引起了其他一些蛋白的表達(dá)和修飾的改變，如Cofilin等蛋白表達(dá)量的變化。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，Cofilin在缺氧缺血條件下先升高而后逐漸降低。LIMK是Cofilin的上游信號(hào)分子，LIMK的激活引起Cofilin的磷酸化，后者在細(xì)胞中先升高（24 h）然后降低，至14 d又出現(xiàn)高峰，21 d降低。Cofilin具有切割肌動(dòng)蛋白纖絲的活性，而p-Cofilin則使Cofilin蛋白失活，從而提高F-肌動(dòng)蛋白的穩(wěn)定性，或促進(jìn)G-肌動(dòng)蛋白聚合成F-肌動(dòng)蛋白的功能［10］。

在缺氧缺血條件下，ERK的磷酸化形式（p-ERK）亦有較大改變，且類似p-Cofilin的變化趨勢，也出現(xiàn)2個(gè)高峰。ERK是MAPK家族的一員，受到生長因子等有絲分裂的刺激，并參與多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及遷移等細(xì)胞行為。ERK受多種因素刺激可被廣泛激活，在細(xì)胞增殖以及在細(xì)胞分化發(fā)育惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，近來有報(bào)道其在缺氧缺血腦損傷后大鼠腦中表達(dá)升高，并與GAP-43等敏感基因表達(dá)相關(guān)［11，12］。

從免疫組化結(jié)果來看，缺氧缺血后損傷腦組織p-Cofilin表達(dá)明顯比對(duì)照組增強(qiáng)，也比相同實(shí)驗(yàn)組的Cofilin表達(dá)明顯增強(qiáng)。Cofilin作為一種絲切蛋白，具有切斷絲狀肌動(dòng)蛋白的作用，在細(xì)胞的遷移、發(fā)育及再生過程中起重要作用。本研究中發(fā)現(xiàn)缺氧缺血腦損傷后大腦海馬組織中Cofilin蛋白磷酸化明顯增強(qiáng)，其具體意義尚有待探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中低氧箱自動(dòng)調(diào)控系統(tǒng)基本上是可靠的，其效果是明確的，但仍存在一些問題。如在使用中尚需人為監(jiān)測氧氣濃度降低的速度，過快的速度則容易引起動(dòng)物死亡，造成實(shí)驗(yàn)失敗。因此，本低氧箱尚需進(jìn)一步改進(jìn)和完善，使其更加適用于動(dòng)物缺氧缺血腦損傷方面的研究。

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