陶陶，王敏

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占第二位［1］，死亡率仍徘佪在70%左右，高居婦科惡性腫瘤首位，晚期患者的5年生存率僅為25%～30%［2］。盡管近年來手術(shù)、化學(xué)藥物治療和放射治療技術(shù)不斷改進，卵巢癌5年生存率仍無明顯提高［3］。其中最重要一個原因是30%～40%的卵巢癌患者對化療耐藥；不僅如此，60%對一線化療敏感的卵巢癌患者在半年以后也產(chǎn)生耐藥。因此明確卵巢癌耐藥的確切機制以及耐藥逆轉(zhuǎn)已成為當(dāng)前全球婦產(chǎn)科學(xué)界極其緊迫而重要的研究課題。microRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一種發(fā)育時序性基因［4］，與婦科惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。microRNA芯片是用來檢測microRNA表達譜的一種生物芯片，適用于大規(guī)模的基因檢測和基因功能的研究、疾病發(fā)生機制的研究及臨床診斷等方面。本研究采用microRNA表達譜基因芯片方法檢測化療耐藥及敏感卵巢癌細胞差異表達microRNA后，選取部分差異表達的microRNA進行實時聚合酶鏈反應(yīng)驗證，從基因水平研究卵巢漿液性癌化療耐藥發(fā)生的相關(guān)機制，為卵巢漿液性癌的積極治療及改善預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 microRNA表達譜基因芯片與卵巢癌細胞：microRNA表達譜基因芯片為北京博奧生物有限公司提供的Affymetrix基因芯片。microRNA表達譜基因芯片檢測的細胞為紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3，均由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院提供。

1.1.2 實時聚合酶鏈反應(yīng)的臨床標(biāo)本：收集2008年8月至2011年8月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)手術(shù)切除后病理學(xué)檢查證實為卵巢漿液性癌的新鮮組織標(biāo)本共106例。所有卵巢漿液性癌患者均具備完整的病理資料，對系統(tǒng)行紫杉醇+卡鉑化療治療患者的化療情況跟蹤隨訪6個月，其中化療耐藥組20例，化療敏感組20例。40例卵巢漿液性癌患者年齡38～79歲，平均年齡55.25歲。絕經(jīng)后患者33例，絕經(jīng)前患者7例。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2009年手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期4例，Ⅱ期7例，Ⅲ期29例，Ⅳ期0例；G1級1例，G2級20例，G3級19 例；分期行淋巴結(jié)清掃術(shù)26例，其中有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例?；熌退幖懊舾袠?biāo)準(zhǔn)根據(jù)2010年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)卵巢癌臨床實踐指南，腫瘤在6個月內(nèi)復(fù)發(fā)的患者為化療耐藥，初次化療后6個月或更長時間復(fù)發(fā)的患者被認為是“敏感”的病例［5］。

1.2 實驗方法

1.2.1 microRNA表達譜基因芯片檢測：按照總RNA的提取說明書抽提基因芯片總RNA，對基因芯片靶標(biāo)制備及標(biāo)記microRNA，進行芯片雜交染色及掃描并檢測與分析。

1.2.2 實時聚合酶鏈反應(yīng)：為鑒定表達譜基因芯片，對miR-17～92基因簇在卵巢漿液性癌組織中采用實時聚合酶鏈反應(yīng)方法進行檢測。（1）提取組織的總RNA：用液氮法提取組織中的總RNA置于0.01%DEPC-H2O中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）cDNA合成：按反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimescriptTMRT reagent Kit）產(chǎn)品說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用10 μL反應(yīng)體系。（3）擴增：用TaqMan microRNA試劑盒提供的特異的實時聚合酶鏈反應(yīng)引物對合成的cDNA進行實時聚合酶鏈反應(yīng)。每個標(biāo)本都用β-actin作為內(nèi)對照，β-actin的水平同樣用TaqMan探針法進行測定。其中miR-17～92基因簇引物及探針序列：F5′-CAGTAAAGGTAAGGAGAGCTCAATCTG-3′；R5′-CA TACAACCACTAAGCTAAAGAATAATCTGA-3′；6-FA M-TGGAAATAAGATCATCATGCCCACTTGAGAC-TA MRA。β-actin 引物及探針序列：F5′-GCAAAGACCT GTACGCCAACA-3′；R5′-TGCATCCTGTCGGCAATG-3′；6-FAM-TGGCGGCACCACCATGTACC-TAMRA。經(jīng)過PCR反應(yīng)后得到擴增曲線。將底物用DEPC水按照10 倍梯度稀釋成1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000，進行實時聚合酶鏈反應(yīng)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

分析實時聚合酶鏈反應(yīng)中基因表達的相對變化采用改良的相對定量法（Fold induction=2ΔCt），采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對所得結(jié)果進行兩兩樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 microRNA表達譜基因芯片結(jié)果

根據(jù)Affymetrix基因芯片技術(shù)分別檢測紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3中microRNA表達，檢測出原始芯片數(shù)據(jù)共2張，對檢測出原始芯片數(shù)據(jù)采用聚類分析軟件CLUSTER3.0分析，表達譜基因芯片可篩查出不同表達的microRNA，其中黃色代表高表達，藍色代表低表達（圖1）。

2.2 差異表達microRNA的數(shù)據(jù)分析

利用p-value方法對基因芯片雜交結(jié)果進行分析，篩選出171個相關(guān)的microRNA，其中miR-17、miR-19b、miR-92-1、miR-210、miR-1307 等 69 個microRNA 高表達 （上調(diào)趨勢），miR-134、miR-34、miR-196b等102個microRNA低表達（下調(diào)趨勢）。miR-17～92基因簇是與卵巢癌耐藥最相關(guān)的microRNA之一。見表1。

2.3 實時聚合酶鏈反應(yīng)對miR-17～92在卵巢漿液性癌組織中的驗證結(jié)果

由已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），根據(jù)樣品的Ct值求出樣品的模板量，以確定應(yīng)用目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率一致。應(yīng)用實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-17～92基因簇在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織中擴增曲線（圖3），miR-17～92基因簇在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織中平均Ct值分別為28.745～35.845及28.175～31.46，β-actin平均 Ct值分別為17.17～22.41及18.175～21.38。miR-17～92基因簇在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中的表達量為2.2143E3±6.97E2，在化療敏感卵巢漿液性癌組織中的表達量為1.4841E3±6.44E2，化療耐藥組中的表達量水平顯著高于化療敏感組（P<0.01），與芯片結(jié)果一致。

2.4 miR-17～92基因簇表達與卵巢漿液性癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

miR-17～92基因簇表達量與卵巢漿液性癌患者絕經(jīng)前后、手術(shù)病理分期、組織學(xué)分級、是否行淋巴結(jié)清掃術(shù)和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性（P值分別為0.648、0.377、0.896、0.692、0.274，均 P>0.05），對20例化療耐藥卵巢漿液性癌miR-17～92基因簇表達進一步分析亦與其臨床病理學(xué)特征無關(guān)（P值分別為0.142、0.574、0.428、0.784、0.874，均 P>0.05），見表2。

3 討論

microRNA是一種發(fā)育時序性基因，microRNA與腫瘤的關(guān)系已在多種腫瘤中得到證實。大量的研究表明，microRNA在女性生殖系統(tǒng)疾病，包括卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮平滑肌瘤、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥等的表達密切相關(guān)［6～8］。表達譜基因芯片技術(shù)通過對mRNA的熒光分子進行標(biāo)記來檢測基因表達水平的變化，是集分子生物學(xué)、細胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)、生物信息學(xué)等多種高新技術(shù)為一體的研究手段，它是一種對基因序列及功能進行大規(guī)模、高通量的研究方法。有關(guān)卵巢癌與正常卵巢組織或細胞的表達譜基因芯片研究已有報道，但應(yīng)用表達譜基因芯片對紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3進行基因表達譜分析尚未見報道。

我們通過對紫杉醇耐藥卵巢癌細胞skov3-tr30及其敏感細胞skov3進行基因表達譜芯片分析，篩選出了171個與紫杉醇耐藥卵巢癌細胞相關(guān)的microRNA，基因表達增高（上調(diào)趨勢）69個，為miR-17、miR-19b、miR-92-1、miR-210、miR-1307 等，基因表達降低（下調(diào)趨勢）102個，為miR-134、miR-34、miR-196b等，我們發(fā)現(xiàn)miR-17～92是與卵巢癌耐藥最相關(guān)的microRNA之一，因此認為microRNA表達譜基因芯片可篩查出化療耐藥及敏感卵巢癌細胞的差異表達基因，miR-17～92基因簇與卵巢癌化療耐藥有關(guān)。miR-17～92是一個典型的多順反子miRNA基因簇，在人類基因組中位于染色體13q31.3基因cl3或f25的內(nèi)含子3上，此區(qū)域在多種類型淋巴瘤及實體瘤中被擴增［9］，與細胞增殖有關(guān)。miR-17～92基因簇大約占據(jù)人類染色體的800對堿基對，包括miR-17、miR-18a、miR-20a、miR-19a、miR-19b 和miR-92-1。它參與了心、肺、免疫系統(tǒng)的發(fā)育、血管生長及前脂肪細胞分化等過程。miR-17～92基因簇誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生主要是通過抑制抑癌基因和細胞周期調(diào)控基因的表達實現(xiàn)的。細胞增殖周期調(diào)節(jié)失控是惡性腫瘤的一個重要特征，miR-17～92基因簇參與腫瘤的發(fā)生也與其干擾細胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。在離體條件下，轉(zhuǎn)染miR-17～92基因簇到不同的淋巴瘤細胞中能使促凋亡蛋白基因BIM和抑癌基因p21的表達下調(diào)［10］。我們前期應(yīng)用病毒介導(dǎo)法將構(gòu)建的與卵巢癌耐藥最相關(guān)的miR-17～92抑制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入耐藥卵巢癌細胞抑制其表達，發(fā)現(xiàn)miR-17～92基因簇可以抑制耐藥卵巢癌細胞的增殖，使耐藥卵巢癌細胞阻滯在G2/M期。

目前有關(guān)microRNA在卵巢癌化療耐藥中的作用研究主要集中在表達譜基因芯片的建立上，對于篩查出的microRNA在卵巢癌化療耐藥中的功能角色的研究才剛剛起步。Boren等［11］及Orrentino等［12］已證明microRNA表達的不同與卵巢癌化療耐藥與敏感有關(guān)。如miR-214通過影響PTEN以及蛋白激酶B（Akt/PKB）的功能，誘導(dǎo)細胞存活和順鉑耐藥［13］。我們隨后選取化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織各20例進行實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-17～92基因簇，比較表達譜基因芯片與實時聚合酶鏈反應(yīng)表達結(jié)果是否一致。發(fā)現(xiàn)miR-17～92基因簇在化療耐藥卵巢漿液性癌組織表達明顯上調(diào)，化療敏感組織表達下調(diào)，與芯片結(jié)果一致。本研究首次表明，miR-17～92基因簇在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織有差異表達，與卵巢漿液性癌化療耐藥相關(guān)。Lewis等［14］研究認為，miR-17～92通過PTEN和BIM起作用，miR-17～92作用于靶蛋白后如何參與卵巢癌的耐藥及其相關(guān)耐藥通路的調(diào)控，值得進一步深入研究。因此，對microRNA進行分析可為卵巢漿液性癌化療耐藥的研究提供理論依據(jù)，可作為化療耐藥卵巢癌患者治療及預(yù)后的新靶點，為卵巢癌患者的化學(xué)藥物治療提供了新的研究方向，有可能成為新的基因治療途徑，對改善卵巢癌患者的治療現(xiàn)狀具有重要的現(xiàn)實意義。

［1］Greenlee RT，Hall Harmon MB，Murray T，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Chin，2001，51（1）：15-36.

［2］樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：334.

［3］McGuire V，Jesser CA，Whittemore AS.Survival among US women with invasive epithelial ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2002，84（3）：399-403.

［4］Golub TR，Slonim DK，Tamayo P，et al.Molecular classification of cancer：class discovery and class prediction by gene expression monitor［J］.Science，1999，286（5439）：531-537.

［5］Fung-Kee-Fung M，Oliver T，Elit L，et al.Optimal chemotherapy treatment for women with recurrent ovarian cancer［J］.Curr Oncol，2007，14（5）：195-208.

［6］婁艷輝，楊興升，王福玲.miR-21在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床意義［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（3）：608-610.

［7］Nam EJ，Yoon H，Kim H，et al.MicroRNA expression profiles inserous ovarian carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2008，14（9）：2690-2695.

［8］Laios A，O′Toole S，F(xiàn)lavin R，et al.Potential role of miR-9 and miR-223 in recurrent ovarian cancer［J］.Mol Cancer，2008，7：35-48.

［9］He L，Thomson JM，HemannM T，et al.A microRNA polycistron as a potential human oncogene［J］.Nature，2005，435（7043）：828-833.

［10］Inomata M，Tagawa H，Guo YM，et al.MicroRNA-17-92 down-regulates expression of distinct targets in different B-cell lymphoma subtypes［J］.Blood，2009，113（2）：396-402.

［11］Boren T，Xiong Y，Hakam A，et al.MicroRNAs and their target messenger RNAs associated with ovarian cancer response to chemotherapy［J］.Gynecol Oncol，2009，113（2）：249-255.

［12］Sorrentino A，Liu CG，Addario A，et al.Role of microRNA in drug resistance ovarian cancer cells［J］.Gynecol Oncol，2008，111（3）：478-486.

［13］Yang H，Kong W，He L，et al.MicroRNA expression profiling in human ovarian cancer：miR-214 induces cell survival and cisplatin resistance by targeting PTEN ［J］.Cancer Res，2008，68 （2）：425-433.

［14］Lewis BP，Shih IH，Jones-Rhoades MW，et a1.Prediction of mammalian microRNA targets［J］.Cell，2003，115（7）：787-798.