李海燕，曹勵(lì)民，王秉亮

（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，西安 710021；2.中鐵一局集團(tuán)中心醫(yī)院普外科，西安 710021）

肝癌為世界第六大惡性腫瘤，影響肝癌預(yù)后的主要因素就是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。臨床資料顯示，約60%以上的肝癌（含早期肝癌）確診時(shí)已發(fā)生臨床或顯微鏡下轉(zhuǎn)移［1］。因此，抗肝癌治療的關(guān)鍵在于抗侵襲轉(zhuǎn)移。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）已廣泛用于白血病的治療，新近研究發(fā)現(xiàn)［1～3］，它還可抑制乳腺癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，但其作用機(jī)制還不明確。人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721是來源于人低分化肝細(xì)胞癌的細(xì)胞系，與正常肝細(xì)胞比較，增殖速度快，具有較強(qiáng)的惡性行為（如遷移能力和侵襲能力）。因此我們探討ATRA對人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721遷移侵襲能力的影響，為ATRA應(yīng)用于臨床的肝癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所），以PRMI1640培養(yǎng)基+10%小牛血清常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與配制：ATRA購自Sigma公司，以二甲基亞礬（DMSO）配制。小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），Matrigel膠（美國BD公司），Transwell侵襲小室 （Coming公司），fluorophore Sybr Green（Netherlands 公司），Total RNA Kit（Omega 公司）。BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司），CD147、MMP-2、α-tublin一抗（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 劃痕試驗(yàn)：把1×106個(gè)SMMC-7721細(xì)胞種植于6孔板，至細(xì)胞融合狀態(tài)（90%），血清培養(yǎng)基饑餓24 h；用10 μL移液器槍頭在培養(yǎng)板底部做“十”字劃痕，劃痕時(shí)要用直尺定位。加新鮮無血清培養(yǎng)基，加入 ATRA，調(diào)節(jié)濃度分別為10、20、40 μmol·L-1。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡觀察并拍照，使用Image J軟件測量并統(tǒng)計(jì)劃痕區(qū)寬度。未處理組（對照組）與實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)平行樣本。

1.2.2 Transwell小室試驗(yàn)：無血清培養(yǎng)基與Matrigel膠以9∶1配制，放Transwell小室于24孔板內(nèi)，將稀釋好的Matrigel膠50 μL置于Transwell上層。37℃過夜，待Matrigel膠凝固后，每孔加無血清培養(yǎng)基300 μL，每個(gè)孔種植細(xì)胞1×105個(gè)，加入ATRA，調(diào)節(jié)藥物濃度為10、20、40 μmol·L-1，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。24 h后分別取出小室，分別以PBS清洗3次，棉簽刮除濾膜上的細(xì)胞，膜下面細(xì)胞用甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗3次。倒置顯微鏡下高倍鏡觀察并拍照，Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)值，結(jié)果以細(xì)胞數(shù)表示。

1.2.3 Real-time PCR：以10，20，40 μmol·L-1ATRA處理細(xì)胞，在24 h以Total RNA Kit提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。GAPDH、CD147、MMP-2基因引物及內(nèi)參GAPDH基因引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)參數(shù)參考文獻(xiàn)［4，5］，引物經(jīng)上海生物工程有限公司合成。CD147，F(xiàn)：5′-ACTCCTCACCTGCTCCTTGA，R：5′-GCC TCCATGTTCAGGTTCTC-3′；MMP-2，F(xiàn)：5′-GGCAGTG CAATACCTGAACACC-3′，R：5′-GTCTGGGGCAGTCC AAAGAACT-3′；GAPDH，F(xiàn)：5′-GCACCGTCAAGGCTG AGAAC-3′，R：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。用儀器 CFD3120 MiniOpticon Detector（美國BIO-RAD公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，按儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置及操作。結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法計(jì)算［6］。

1.2.4 Western blot：以10、20、40 μmol·L-1ATRA 處理細(xì)胞，在24 h收集細(xì)胞，以RIPA細(xì)胞裂解液（加1∶100 PMSF）裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。蛋白質(zhì)定量變性后上樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)膜75 min。將轉(zhuǎn)有蛋白條帶的膜常規(guī)封閉、洗膜后分別與特異性一抗4℃孵育過夜，PBST洗4次，每次5 min，二抗室溫孵育1 h，PBST洗4次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光劑檢測蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。觀察各條帶深淺變化并加以分析，α-tublin作為對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果在凝膠成像儀上照相并使用BIO-RAD公司Quantity One分析軟件測量條帶灰度值，目的條帶與α-tublin條帶灰度值比值即為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATRA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組的SMMC-7721在24 h，細(xì)胞距離比0 h減少（P<0.05），這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力較強(qiáng)。各劑量ATRA實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞在0 h劃痕距離比較一致，但以ATRA處理24 h后，較對照組劃痕距離增加（P<0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ATRA可呈劑量依賴性抑制SMMC-7721細(xì)胞的遷移能力（圖1）。

2.2 ATRA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示，10，20，40 μmol·L-1ATRA處理SMMC-7721細(xì)胞24 h后，穿膜細(xì)胞數(shù)分別為55.3±0.52、42.8±0.21、31.1±0.34，與對照組（73.6±0.45）比較，明顯減少（P<0.05），該結(jié)果表明 ATRA可呈劑量依賴性降低SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力（圖2）。

2.3 ATRA對SMMC-7721細(xì)胞CD147表達(dá)的影響

Real-time PCR 結(jié)果顯示，以10、20、40 μmol·L-1ATRA處理SMMC-7721細(xì)胞24 h后，CD147mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01）；Western blot結(jié)果顯示，10、20、40 μmol·L-1ATRA處理 SMMC-7721細(xì)胞24 h后，CD147蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05），呈劑量依賴性（圖3、圖 4）。

2.4 ATRA對SMMC-7721細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響

Real-time PCR 結(jié)果顯示，以10、20、40 μmol·L-1ATRA處理SMMC-7721細(xì)胞24 h后，MMP-2mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示，以10、20、40 μmol·L-1ATRA處理SMMC-7721細(xì)胞24 h后，與對照組比較MMP-2蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ATRA可呈劑量依賴性明顯下調(diào)MMP-2（圖5、圖 6）。

3 討論

惡性腫瘤患者死亡的主要原因是侵襲和轉(zhuǎn)移。因此抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移就成為了治療腫瘤的突破點(diǎn)，尋找抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物更是研發(fā)的熱點(diǎn)［7～9］。在腫瘤發(fā)展過程中，抑制腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移都有可能降低腫瘤的轉(zhuǎn)移能力［10～15］。

ATRA作為誘導(dǎo)分化劑在急性早幼粒細(xì)胞白血病中的應(yīng)用取得了令人鼓舞的成效，近年來，很多研究者已從細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)的角度對胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤用ATRA進(jìn)行誘導(dǎo)、分化治療。初步的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATRA對惡性腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化、抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡等作用，同時(shí)在抑制實(shí)體腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中也逐漸顯示作用［16］。

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)是目前常用的體外研究腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲行為的經(jīng)典方法。在劃痕愈合實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，對照組具有很強(qiáng)的遷移能力，劃痕后24 h，劃痕處大部分愈合。而在實(shí)驗(yàn)組，ATRA作用于SMMC-7721細(xì)胞后，其遷移能力卻非常弱，對比劃痕0 h的圖片結(jié)果，經(jīng)過24 h的培養(yǎng)劃痕處未見愈合。這與陳宏輝等［17］研究結(jié)果一致；Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，我們的研究表明，隨著ATRA作用于SMMC-7721細(xì)胞時(shí)間的延長，與對照組比較，SMMC-7721細(xì)胞的穿膜數(shù)明顯降低，這提示ATRA可呈劑量依賴性抑制SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力，這與汪思應(yīng)等［18］和李冰等［19］的研究結(jié)果一致。

CD147是一種高表達(dá)于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族成員，參與肝癌細(xì)胞的生長調(diào)控以及侵襲、轉(zhuǎn)移等多種過程，其表達(dá)量的高低與肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥性形成等惡性行為存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，是一種影響治療效果和預(yù)后的重要標(biāo)志性分子。我們的研究結(jié)果顯示，ATRA無論從mRNA水平還是蛋白水平均呈劑量依賴性下調(diào)CD147的表達(dá)。

細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶 （extracellular matrix metalloproteinase，MMPs），是一個(gè)鋅離子依賴的蛋白酶家族，目前已發(fā)現(xiàn)26個(gè)成員。MMPs的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞利用MMPs的基質(zhì)降解能力遷移到其他部位。在腫瘤與間質(zhì)交界處，MMPs往往呈高表達(dá)。研究證實(shí)，CD147能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞本身表達(dá)MMPs，尤其是MMP-2增加明顯。我們的研究結(jié)果顯示，ATRA無論從mRNA水平還是蛋白水平均呈劑量依賴性下調(diào)MMP-2表達(dá)。

本研究初步證明了ATRA能夠抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力，該作用可能與下調(diào)CD147引發(fā)的MMP-2下調(diào)有關(guān)，具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。上述研究為ATRA抑制肝癌侵襲與轉(zhuǎn)移的臨床應(yīng)用提供了思路。

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