蘇朋俊，袁宇航，張志波，黃英，王大佳

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院小兒外科，沈陽110004）

先天性肛門直腸畸形（anorectal malformations，ARM）是小兒常見的先天性消化道畸形，據(jù)文獻報道，其發(fā)生率為1/5000～1/1500，居先天性消化道畸形首位，其畸形發(fā)生的病理機制十分復雜，至今具體原因不清［1，2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)P63基因與脊椎動物肢體末端、肛門直腸和泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育密切相關［3，4］，但在ARM胚胎發(fā)育過程中的表達及作用尚不清楚。本研究通過乙烯硫脲（ethylenethiourea，ETU）誘導Wistar大鼠胚胎產(chǎn)生肛門直腸畸形動物模型，觀察P63在肛門直腸發(fā)育過程中的表達情況，探討P63在肛門直腸畸形胚胎發(fā)生機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成熟未育的Wistar大鼠妊娠第10天（E10，Ex表示大鼠妊娠第X天）經(jīng)胃管注入乙烯硫脲（125 mg/kg），制作 ARM 大鼠動物模型（20只）。正常對照組：12只大鼠于妊娠第10天經(jīng)胃管注入等量的生理鹽水。分別于E13～E16正常組各取3只、畸形組（ARM組）各取5只孕鼠，取出所有胎鼠置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，進行矢狀面連續(xù)切片，厚4 μm。另一部分胎鼠置于液氮中保存，以備提取組織蛋白和mRNA。顯微鏡下觀察，確定肛門直腸畸形的存在，合并神經(jīng)管閉合不全、腰骶部脊膜膨等畸形未列入本實驗研究。

1.2 免疫組化染色

將正常組切片和已確認肛門直腸發(fā)育畸形的胎鼠正中矢狀面連續(xù)切片，進行P63免疫組化染色，采用SP法，參照試劑盒推薦方法進行操作：一抗為1∶200山羊抗大鼠P63抗體（美國Santa Cruz公司），4℃孵育12 h，DAB顯色，蘇木素復染，逐步脫水、透明后封片。P63免疫組織化學染色見胞核呈棕黃色為陽性。每次染色均設陰性和陽性對照。應用NIS-Elements Basic Research軟件進行圖像分析。

1.3 Western blot方法

應用手工顯微切割方法準確切取泄殖腔標本，采用南京凱基全蛋白提取試劑盒提取總蛋白。按改良Lowry法測定，提取40 μL總蛋白，經(jīng)6%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜（Invitrogen公司）上，5%牛血清白蛋白封閉抗原后，加入山羊抗大鼠P63抗體（1∶200稀釋，Santa Cruz公司）和 β-actin抗體（1∶5000稀釋，Sigma公司），4℃孵育12 h。次日洗膜后加堿性磷酸酶標記的兔抗山羊IgG（工作濃度1∶2000，Santa Cruz公司）進行二抗雜交、顯色。結(jié)果采用GIS-2020凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果，對蛋白質(zhì)含量進行密度分析，以相對灰度值代表表達量。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對蛋白質(zhì)含量進行密度分析，以相對灰度值代表蛋白表達量。

1.4 熒光實時定量PCR（qRT-PCR）方法

正常組及ARM組胎鼠冰凍切片，采用手工顯微切割法切取胚胎肛門直腸標本。（1）各組織標本50 mg，參照 TRIzolTMRNA Isolation Reagent提取RNA；經(jīng)紫外分光光度法檢測濃度；（2）應用Prime－Script1st Strand cDNA Synthesis Kit將總RNA轉(zhuǎn)換為 cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系 （10 μL）：5×PrimescriptTMBuffer（for Real Time）2 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I0.5 μL，Oligo dT Prime （5O μmol/L ）0.5 μL，Random 6 mer（100 μmol/L）0.5 μL，RnaseFree dH2O加至10 μL，37 ℃15 min，85 ℃5 s；（3） 提 cDNA 樣品，依次作10 倍倍比稀釋（106～10 copies/μL），以判斷PCR的擴增效率。利用Primer5.0軟件設計引物：P63F5′-CCACGATGAGGTCAGAGATG-3′，R5′-CTGAAACAGATGT TCTCTCAAGTC-3′，退火溫度為57℃，片段擴增長度234 bp。內(nèi)參照選用β-actin，片段擴增長度190 bp，45個循環(huán)后制作熔點曲線，明確產(chǎn)物特異性；⑷測定各個樣品P63和β-actinmRNA Ct值，相對定量方式每個樣品P63的△Ct，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。根據(jù)△△Ct=△Ct目的基因-△Ct參照因子，計算2-△△Ct。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

正常對照組大鼠共產(chǎn)胎鼠192只，無畸形發(fā)生。ARM組胎鼠196只，肛門直腸畸形發(fā)生率為67.9%（133/196）。

2.1 免疫組化結(jié)果

正常對照組大鼠第13天時，大量的P63陽性細胞分布于尿直腸隔、后腸和泄殖腔膜的上皮層（圖1A）；第14天時，陽性細胞主要出現(xiàn)在尿直腸隔與泄殖腔膜的接近融合區(qū)域，同時，后腸的末段和尿道組織內(nèi)也可見大量的陽性細胞（圖2A）；第15天，尿直腸隔與泄殖腔膜的融合區(qū)域的上皮內(nèi)可見大量的陽性細胞；菲薄的肛膜上也出現(xiàn)免疫反應強的陽性細胞，并且免疫反應的強度幾乎達到頂峰（圖3A）；第16天，肛膜破裂，肛門直腸形成，P63在肛管黏膜層表達及外層表皮中表達，但在直腸遠端不表達（圖4A）。

ARM組大鼠第13天，P63表達于尿直腸隔和后腸上皮中，強度極弱，在泄殖腔膜上皮細胞中僅見到零星的陽性細胞分布（圖1B）。第14天，在泄殖腔膜、泄殖腔隔、后腸的上皮中可以觀察到散在分布的陽性細胞（圖2B）。第15天，直腸尿道瘺清晰可見，P63在瘺管和直腸遠端上皮中表達明顯較弱（圖3B）。第16天，陽性細胞散在出現(xiàn)在瘺管和直腸末端上皮中，表達較弱（圖4B）。

2.2 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，P63的表達在ARM組中表現(xiàn)出相對的時間不均衡性。在肛門形成的關鍵時期（第14天和15天），正常組P63的表達量達到頂峰，分別為94.67±3.5和144.13±2.9；而在ARM組表達量明顯下降，分別為46.17±2.1和 86.79±3.5，2 組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；第16天，在正常組和ARM組均可見P63的表達減弱（P<0.05，圖5）。

2.3 qRT-PCR結(jié)果

在正常和ARM組大鼠胚胎中均能檢測出P63表達。在胎齡14～15 d為表達高峰期，胎齡16 d后逐漸降低。ARM組與正常組比較，P63mRNA的表達在13～16 d明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，圖 6）。

3 討論

ARM是小兒外科最常見的消化道畸形，其病理改變除肛門直腸缺陷外，還常合并其他畸形，是一個涉及多因素的復雜疾病，其病因及胚胎形成機制至今未完全闡明。近年來流行病學和動物實驗表明遺傳因素在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，有研究表明Shh/HOX 信號通路［5］、EphB2［7］以及 Wnt5a/Tcf4［8，9］參與了肛門直腸畸形的發(fā)生。

P63基因是P53基因家族中的成員之一，在DNA序列上與P53基因高度同源，主要包含P53家族經(jīng)典的3部分結(jié)構(gòu)，即N-端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、核心DNA結(jié)合區(qū)和寡聚化區(qū)。P63基因位于人類第3號染色體，在人類多種器官組織，如皮膚、口咽、腭、胸腺、胎盤、睪丸、腎盂、子宮頸等各種上皮組織的基底細胞中表達；而在胚胎發(fā)育過程中，P63基因特定地在胚胎外胚層和中胚層及上皮組織中表達［10］。由于P63基因具有不同啟動子和多種內(nèi)含子剪接方式，不同異構(gòu)體間可以相互并存、相互拮抗，因此P63基因在胚胎發(fā)育的不同時期、不同器官，甚至是同一組織器官的不同發(fā)育階段，發(fā)揮著重要的生物學功能。在胚胎發(fā)育的復雜過程中，P63的不同異構(gòu)體間相互轉(zhuǎn)化，既能夠激活目的靶DNA序列，也能夠抑制轉(zhuǎn)錄、合成；既能夠維持組織結(jié)構(gòu)塑形，也能夠誘導構(gòu)型轉(zhuǎn)換；既可以促進細胞的增殖，也可以誘導細胞凋亡。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，在外胚層發(fā)育不良、手足裂畸形和面部裂的人類疾病中均存在P63基因顯性突變［11，12］。同時有研究發(fā)現(xiàn)，P63 參與了肛門直腸畸形發(fā)生相關的Shh/Gli2、Bmp4、Hox等基因的調(diào)控［13］，是外胚層、面部、膀胱泌尿生殖器、直腸和四肢發(fā)育的一個關鍵調(diào)節(jié)因子。P63基因缺陷的小鼠出生后四肢截短，毛囊、牙齒、淚腺或唾液腺、皮膚、前列腺、乳腺和尿道上皮、膀胱壁缺如、泄殖腔畸形和肛門閉鎖等結(jié)構(gòu)畸形［3，4］。此外也有研究發(fā)現(xiàn)，P63下游調(diào)控基因DLX5、BMP7等也參與了消化道末端的發(fā)育，敲除DLX5、BMP7基因的小鼠出現(xiàn)尾端發(fā)育不良、泄殖腔畸形［14，15］。

本研究通過免疫組織化學方法、Western blot和qRT-PCR方法檢測正常胎鼠和ETU致肛門直腸畸形胎鼠泄殖腔和直腸P63的表達情況。在大鼠胚胎發(fā)育過程中，正常及畸形泄殖腔中均表達P63基因，并且其表達特點具有時空依賴性；通過免疫組化染色連續(xù)動態(tài)觀察P63在正常和ARM胎鼠肛門直腸區(qū)的表達時發(fā)現(xiàn)其表達具有明顯差異。在E13～16，P63主要表達于尿直腸隔和泄殖腔膜或肛管（瘺管）上皮，并且在E14、E15時表現(xiàn)為強陽性。P63在ARM組泄殖腔和直腸黏膜亦有表達，但表達強度較正常組明顯減低。通過Western blot和qRT-PCR的方法，發(fā)現(xiàn)在肛門形成的關鍵時期即胎齡14 d和15 d時在正常組P63的蛋白和mRNA的水平達到最高水平，說明在肛門直腸發(fā)育過程中P63可能發(fā)揮了重要的作用；而在同時期的ARM組表達明顯降低（P<0.05）。因此我們認為，在胚胎泄殖腔發(fā)育的關鍵時期，特異性P63表達下調(diào)會干擾肛門直腸的正常發(fā)育，影響了靶基因在此區(qū)域的轉(zhuǎn)錄和翻譯，導致泄殖腔尾區(qū)細胞周期調(diào)控及凋亡程序紊亂、背側(cè)泄殖腔細胞過度凋亡，細胞間黏附分子的轉(zhuǎn)化停滯，背側(cè)泄殖腔細胞運動障礙，尿直腸隔和泄殖腔膜的融合缺陷，產(chǎn)生肛門直腸畸形。

綜上所述，在肛門直腸畸形大鼠胚胎發(fā)育過程中，尿直腸隔及后腸上皮層、泄殖腔膜或肛管（瘺管）上皮層內(nèi)均存在P63的差異表達，P63基因在肛門直腸胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要的作用。泄殖腔/后腸胚胎發(fā)育過程中，P63表達下調(diào)可能影響了下游靶基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯，或者影響了體內(nèi)其他信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，進而導致肛門直腸畸形的發(fā)生。

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