婁志偉，王 爽，李玲玲 ，張鵬宇，王文彪 ，和翀翼*

（1.寵愛一生寵物醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾，161003；3.哈爾濱大江牧業(yè)科技有限公司，黑龍江哈爾濱 150038；4.天津艾森生物工程有限公司，天津靜?？h天宇科技園5號 301609）

奶牛子宮內(nèi)膜炎（endometritis）是指炎癥僅局限于子宮內(nèi)膜的病理過程[1]，是奶牛最常見的產(chǎn)科疾病之一，也是造成奶牛不孕的主要原因之一。其發(fā)病率極高，國外統(tǒng)計其發(fā)病率平均為30%～40%，我國統(tǒng)計為 20%～50%[2、3]。引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生物有細(xì)菌、病毒、真菌、支原體等，但以細(xì)菌感染較為常見。我們對奶牛子宮內(nèi)膜為主要致病菌進(jìn)行藥物敏感性試驗，旨在為臨床選擇安全有效藥物提供理論依據(jù)與試驗支持。

1 試驗材料

1.1 試驗藥品與試劑 金銀花、黃連、黃柏等中藥購于天津市老百姓大藥房；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯及生化試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 試驗菌種 化膿鏈球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌分離鑒定于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)臨床教研室。

1.3 試驗設(shè)備 DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信儀器有限公司）；DGG-9070B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信儀器有限公司）；BCN-1360B型生物潔凈工作臺（天津市生物潔凈儀器廠）

2 試驗方法

2.1 復(fù)方中藥的組方與制備 選取金銀花、連翹、黃連、黃柏、大青葉、蛇床子、苦參、益母草、甘草、川芎、五靈脂、當(dāng)歸十二味中藥進(jìn)行組方。試驗I：金銀花、連翹、黃柏、蛇床子、益母草、川芎、當(dāng)歸、甘草適量組成。試驗II：金銀花、連翹、黃連、大青葉、苦參、益母草、五靈脂、甘草適量組成。并對復(fù)方中藥進(jìn)行提取，濃縮至1g/ml，微孔濾膜過濾，流通蒸汽滅菌30min后備用。

2.2 菌液的制備 將分離鑒定出的病原菌種接種入THB肉湯或普通肉湯（鏈球菌接種于THB肉湯，其它接種于普通營養(yǎng)肉湯），37℃活化24h后，采用麥?zhǔn)媳葷岱?，用THB肉湯和普通肉湯將細(xì)菌縣液稀釋至濁度為106CFU/ml備用。

2.3 體外抑菌試驗

2.3.1 試管二倍稀釋法 分別測定復(fù)方中藥對化膿鏈球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。取滅菌試管10支，編號，于1～9管中各加入無菌肉湯培養(yǎng)基或THB肉湯2ml（鏈球菌接種于THB肉湯），然后于第1管中加入1g/ml的受試中藥提取液2ml，混勻后取出2ml加入第2管，依此類推，直至第8管中取出2ml棄去，第9管為空白對照，第10管為藥液對照。然后1～9管中加入供試菌液或混合菌液0.1ml，搖勻，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。以不發(fā)生渾濁變化的最高藥物稀釋倍數(shù)作為該藥物的MIC值。將所有清晰無菌生長的試管營養(yǎng)液接種于營養(yǎng)平板或THB平板，培養(yǎng)24h，以菌落數(shù)不超過5個的最低藥物濃度作為該藥物的MBC值。根據(jù)MIC值和MBC值評價中藥的體外抗菌活性。

2.3.2 打孔法 取供試菌液0.8ml傾于普通瓊脂平板表面（鏈球菌需THB瓊脂平板），使其均勻平鋪于表面。棄去多余的菌液，置37℃干燥15min，打孔器打孔（直徑6mm）后，在酒精燈火焰上稍微烘烤后，每孔加滿藥液（不能溢出），37℃培養(yǎng)24h，觀察并記錄復(fù)方中藥對種種細(xì)菌抑菌圈直徑的大小（mm），每種藥物作四個重復(fù)。

3 試驗結(jié)果

3.1 復(fù)方中藥對各種細(xì)菌的MIC和MBC試驗結(jié)果

對奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌進(jìn)行中藥試管二倍稀釋法試驗，試驗結(jié)果見表1，由表1可知：試驗I組對五種病原菌的抗菌活性較強，MIC及MBC達(dá)到8～64mg/ml，試驗II組對除金黃色葡萄球菌外的四種病原菌的抗菌活性也較強，MIC及MBC達(dá)到16～64mg/ml。

3.2 復(fù)方中藥對各種細(xì)菌的體外抑菌試驗結(jié)果

注：抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)按《中藥藥理學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑>20mm為極敏，15～19mm為高敏，10～14mm為中敏，10mm以下為低敏，-表示無作用。

對奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌進(jìn)行中藥打孔法試驗，試驗結(jié)果見表2，由表2可知：試驗I組與試驗II組對五種病原菌均有抑菌效果，均能達(dá)到中敏到高敏。

4 分析與討論

中獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為奶牛子宮內(nèi)膜炎屬于帶下癥的范疇，分析其原因一是由于飼喂失調(diào)，勞役過度，損傷脾氣，使運化失常，不能化水谷為精微，反聚而為濕，濕濁下注；或腎氣虧虛，以致腎失閉藏，帶脈失約，使津液滑脫而下；二是由于脾虛濕盛，反而侮肝，肝郁化火，致濕熱下注；三是由于外邪入侵，如配種及人工授精不潔，助產(chǎn)不衛(wèi)生，邪毒客于胞宮之內(nèi)，與氣血相搏，因而發(fā)病，或產(chǎn)后惡露不盡，或胎衣殘留胞宮，致使瘀血停滯胞宮之內(nèi)，瘀久化熱而致病。

表1 復(fù)方中藥對各種細(xì)菌的MIC和MBC試驗結(jié)果（單位：mg/mL）

表2 復(fù)方中藥對各種細(xì)菌的體外抑菌試驗結(jié)果 （單位：mm）

藥有個性之特長，方有合群之妙用。試驗I以金銀花、連翹、黃柏抑菌殺菌為主藥，蛇床子、益母草溫腎助陽，兼具殺蟲之效為輔，佐以川芎、當(dāng)歸活血行氣，以甘草為使；試驗II以金銀花、連翹、黃連抑菌殺菌為主藥，輔以益母草溫腎助陽，五靈脂化瘀止血、活血止痛，苦參、大青葉為佐，以甘草為使。藥物共奏抑菌殺菌、活血止痛、解毒消腫、祛腐生新之功效。

中藥對主要病原菌抑菌試驗中選取試管二倍稀釋法與打孔法，對于抑菌作用較強的藥物用打孔法其效果可能被掩蓋，用試管二倍稀釋法比較精確，但有些中藥提取液本身色澤深、混濁度大，在試管內(nèi)培養(yǎng)后不易觀察，因此，本試驗綜合兩種藥物的抑菌作用，試驗結(jié)果基本一致。試管二倍稀釋法試驗結(jié)果表明：試驗I組對五種病原菌的抗菌活性較強，MIC及MBC達(dá)到8～64mg/ml，試驗II組對除金黃色葡萄球菌外的四種病原菌的抗菌活性也較強，MIC及MBC達(dá)到16～64mg/ml。打孔法試驗結(jié)果表明：試驗I組對蠟樣芽孢桿菌為極敏效果，對大腸桿菌及乳房鏈球菌達(dá)高敏效果，對化膿鏈球菌及金黃色葡萄菌均為中敏效果；試驗II組對五種致病菌均為中敏效果。綜合以上試驗結(jié)果，篩選試驗I組進(jìn)行下一步試驗。

[1] 林 羲.家畜病理學(xué)（第三版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：184-185.

[2]趙紅瓊.新疆奶牛子宮內(nèi)膜炎病原菌的分離鑒定及其治療中草藥的篩選.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文[D]，2005，6.

[3]弓素梅.治療奶牛子宮內(nèi)膜炎中藥栓劑的研究[D].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2006.