張革化， 常利紅， 葉 進， 莊士民， 王 凱， 黎景佳△

(中山大學附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東廣州510630)

表皮生長因子樣結構域7(epidermal growth factor-like domain 7，EGFL7)是由 Soncin 等［1］于 2003年首先發(fā)現(xiàn)的一個在血管內皮細胞特異性表達的基因，其編碼蛋白在新生血管“管腔形成”這一關鍵步驟中發(fā)揮重要作用［2］。在生理情況下，EGFL7在胚胎期、新生兒期的原始內皮細胞、各種血管內皮細胞和妊娠期的子宮中呈高表達，而在幾乎所有成年個體的成熟組織中EGFL7均表達下調;某些病理狀態(tài)，如腫瘤、血管損傷及炎癥組織中有大量血管新生的現(xiàn)象，其EGFL7的表達呈明顯上調［3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7在喉鱗狀細胞癌組織中表達上調，其表達水平與喉癌臨床分期、淋巴結轉移和預后有關，多變量Cox風險比例模型分析表明EGFL7表達水平是喉癌預后的獨立預測因子，提示EGFL7表達異常與喉癌的發(fā)生發(fā)展有密切關系［4］。為進一步探討EGFL7表達對喉癌生物學行為的影響，本研究擬構建穩(wěn)定干擾人EGFL7基因的慢病毒載體，并轉染體外培養(yǎng)人喉癌細胞，為研究EGFL7蛋白參與喉癌發(fā)生發(fā)展的作用機制奠定基礎。

材料和方法

1 細胞株

人胚腎上皮293T細胞和感受態(tài)大腸桿菌DH5α由中山大學分子醫(yī)藥生物學實驗室提供，人喉表皮樣癌細胞HEp-2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 主要試劑

pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體、pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negative-control載 體、POLOdelivererTM3000、pLenti6．3-MCS/V5-DEST 系列慢病毒表達載體和慢病毒包裝質粒均購自Invitrogen。Polybrene購自Sigma。質粒Midi抽提試劑盒購自Qiagen。Blasticidin購自Calbiochem。qPCR SYBR Green Mix購自東盛。DMED培養(yǎng)基、胎牛血清和 Opti-MEM培養(yǎng)基均購自Gibco。

3 主要方法

3．1 人EGFL7基因有效干擾靶點的篩選 參考GenBank數(shù)據(jù)庫人EGFL7 cDNA(NM_016215)序列，利用Invitrogen公司的在線設計軟件(http://rnaidesigner．invitrogen．com/rnaiexpress/)，根據(jù) RNAi設計原則［5］，設計4對EGFL7基因的特異性干擾片段，經(jīng)BLAST分析確認其特異性后，由上海銳賽生物技術有限公司合成。

將合成的4對寡核苷酸的各2條鏈等量混勻，于95℃作用5 min退火，冷卻至室溫形成雙鏈寡核苷酸(ds Oligo)，將ds Oligo與線性化的pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR RNAi表達載體連接，轉化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)壯觀霉素篩選陽性克隆，抽提質粒，測序驗證插入序列的正確性，4個候選干擾質粒分別命名為pcDNA6．2-GW/EGFL7-1/2/3/4，對照質粒為 pcDNA6．2-GW/miR-negative-control。

分別取候選干擾質粒和對照質粒，采用POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent轉染293T細胞，于轉染后48 h熒光顯微鏡下觀察EmGFP表達。從干擾質粒轉染的293T細胞中抽提總RNA，Nanodrop核酸定量分析儀測定RNA的濃度。按照Fermentas公司的M-MLV操作說明書進行反轉錄，以反轉錄的cDNA為模板，采用SYBR Green實時熒光定量PCR法分別檢測目的基因的表達(人EGFL7上游引物5’-GATGGCGGGGTGACACTTG-3’，下游引物5’-CACTGTCCACTCCTGTCGGG-3’;人 GAPDH 上游引物 5’-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3’，下游引物 5’-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’)，選取干擾效率最高的質粒進行后續(xù)實驗。

3．2 人EGFL7基因RNAi慢病毒表達載體的構建

以構建好的干擾效率最高的 pcDNA6．2-GW/EGFL7為模板，Lenti-Asc1-F/Lenti-Pme1-R為引物(根據(jù) pLenti6．3-MCS/V5-DEST載體結構設計)，PCR擴增EmGFP-EGFL7-miR片段，使目的片段兩末端分別帶上酶切位點Asc I和Pme I。將EGFL7基因PCR產(chǎn)物和pLenti6．3-MCS/V5-DEST慢病毒載體用Asc I和Pme I分別進行酶切，T4 DNA ligase連接上述酶切后的PCR產(chǎn)物及慢病毒載體。將10μL連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，次日挑取單菌落行菌落PCR，將PCR鑒定呈陽性的克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質粒，送測序驗證，命名為 pLenti6．3-EGFL7-miR。

3．3 慢病毒包裝及滴度測定 用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋EGFL7基因pLenti6．3-EGFL7-miR干擾質粒和Packaging Mix(Invitrogen)包裝質粒，在 POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent介導下轉染293T細胞。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。收獲含病毒的上清液，4℃、3 000 r/min離心10 min，去除細胞碎片。用0．45μm醋酸纖維素膜的濾器過濾上清液于Beckman SW28離心管中，每管30 mL病毒上清，然后將2 mL 20%蔗糖溶液(PBS配制)輕輕加入上清液的底部，形成一個蔗糖墊，4℃、25 000 r/min離心3 h。離心完畢后小心取出超速離心管，小心棄去上清液，留下管底少量的半透明或白色沉淀。將超速離心管倒置在吸水紙上晾干，并用Tip頭吸去管壁上多余的液體。100μL冷PBS重懸，并輕輕吹打溶解沉淀，注意避免產(chǎn)生氣泡，分裝后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以5×108/L的密度將293T細胞接種于24孔板。細胞換液，將梯度稀釋的含病毒培養(yǎng)基分別加入各孔中，同時加入8 mg/L polybrene以增加干擾效率。感染24 h后，更換完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后觀察熒光表達情況，選取合適稀釋度對應的孔，對EmGFP陽性細胞進行計數(shù)，并依此計算待測慢病毒的滴度。

3．4 穩(wěn)定干擾EGFL7表達的細胞株篩選 將處于對數(shù)生長期的HEp-2細胞以密度5×108/L接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)待細胞融合度達到約30% ～50%，分別用pLenti6．3-EGFL7-miR目的病毒和空白病毒顆粒感染HEp-2細胞(MOI=10)，同時加入8 mg/L polybrene增強感染。慢病毒感染48～72 h后觀察熒光，感染效率大于70%時，加入6 mg/L殺稻瘟菌素(blasticidin，BSD)進行藥物篩選，14 d后挑取單克隆，擴大培養(yǎng)。SYBR Green實時熒光定量PCR法(參考方法3．1)鑒定EGFL7穩(wěn)定干擾的細胞，命名為 HEp-2pLenti6．3-EGFL7-miR。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 EGFL7基因有效干擾質粒 pcDNA6．2-GW/EmGFP-EGFL7的構建和篩選

針對目的基因EGFL7 cDNA序列，設計并合成4對特異性miRNA Oligo，見表1。4對miRNA Oligo退火后形成ds Oligo，與線性化的pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR RNAi質粒連接，經(jīng)測序驗證，質粒構建成功。

表1 人EGFL7基因4對特異性寡核苷酸干擾序列Table 1．Specific Oligo sequences for human EGFL7 gene RNA interference

4種候選干擾質粒和對照質粒轉染293T細胞48 h后，熒光顯微鏡下均可觀察到EmGFP表達，見圖1，轉染效率達90%以上。進一步采用實時熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，質粒pcDNA6．2-GW/EGFL7-1干擾效果欠佳，而質粒 pcDNA6．2-GW/EGFL7-2、pcDNA6．2-GW/EGFL7-3 和 pcDNA6．2-GW/EGFL7-4的干擾效應均高于50%，其中質粒pcDNA6．2-GW/EGFL7-3的干擾效應高達69%，見圖2，故選擇質粒pcDNA6．2-GW/EGFL7-3用于后續(xù)實驗。

2 EGFL7基因 pLenti6．3-EmGFP-EGFL7-miR 慢病毒表達載體的構建

以干擾效率最高的pcDNA6．2-GW/EGFL7-3為模板，Lenti-Asc1-F/Lenti-Pme1-R為引物，PCR擴增EmGFP-EGFL7-miR片段，電泳可見清晰的目的基因條帶，見圖3。EGFL7基因 PCR產(chǎn)物與 pLenti6．3-MCS/V5慢病毒載體經(jīng)雙酶切連接后，轉化大腸桿菌，行菌落PCR鑒定陽性克隆(圖4A)。最后，將陽性克隆的菌落接種到LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜，抽提質粒，再次PCR和酶切鑒定(圖4B)，并送測序，證實干擾靶點插入序列正確。

3 慢病毒包裝及滴度測定

在 POLOdelivererTM3000介導下將 pLenti6．3-EGFL7-miR重組慢病毒載體和包裝質粒共轉染293T細胞，熒光顯微鏡觀察可見大量綠色熒光蛋白的表達。收集并濃縮病毒后，經(jīng)逐孔稀釋滴度測定法測定病毒滴度為5×1011TU/L。

4 穩(wěn)定干擾EGFL7表達的喉癌HEp-2細胞株篩選鑒定

分別用pLenti6．3-EGFL7-miR病毒和空白病毒感染HEp-2細胞，于感染后48～72 h加入BSD進行藥物篩選，2周后篩選出穩(wěn)定克隆，見圖5。采用實時熒光定量PCR法檢測證實，穩(wěn)定干擾EGFL7基因表達的HEp-2細胞與空白病毒穩(wěn)轉株細胞相比，EGFL7 mRNA表達下降了97%，干擾效果明顯(P＜0.05)，見圖6。

Figure 1．GFP expression in 293T cells 48 h after transfection(×10)．A:non-transfection group;B:negative control group;C:pcDNA6．2-GW/EGFL7-1 transfection group;D:pcDNA6．2-GW/EGFL7-2 transfection group;E:pcDNA6．2-GW/EGFL7-3 transfection group;F:pcDNA6．2-GW/EGFL7-4 transfection group．圖1 4種候選干擾質粒轉染293T細胞48 h后綠色熒光蛋白的表達

Figure 2．Relative expression of EGFL7 mRNA after transfection．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs negative control group．圖2 4種候選干擾質粒對EGFL7 mRNA表達的影響

Figure 3．PCR results for pcDNA6．2-GW/EGFL7-3 vector．1:marker;2:PCR product of pcDNA6．2-GW/EGFL7-3 plasmid using Lenti-Asc1-F and Lenti-Pme1-R primers．圖3 pcDNA6．2-GW/EGFL7-3載體的PCR結果

Figure 4．Identification of the constructed pLenti-6．3-EGFL7-miR vector．A:colony PCR for cloned target gene．1:marker;2 ～8:the groups with transformants of pLenti6．3-EGFL7-miR;9:the group with positive control;10:the group with ddH2O．B:enzyme digestion．1:marker;2:pLenti6．3-EGFL7-miR vector digested by Asc I and Pme I．3:negative vector without digestion．圖4 慢病毒載體的PCR和酶切鑒定

Figure 5．GFP expression in HEp-2 cells 2 weeks after pLenti-6.3-EGFL7-miR transfection(×10)．A:non-transfection group;B:negative control group;C:pLenti-6.3-EGFL7-miR transfection group．圖5 慢病毒轉染HEp-2細胞經(jīng)BSD篩選2周后綠色熒光蛋白的表達

Figure 6．Relative expression of EGFL7 mRNA after pLenti6．3-EGFL7-miR transfection．Mean ±SD．n=3．*P ＜0．05 vs negative control group．圖6 慢病毒穩(wěn)定轉染喉癌HEp-2細胞后EGFL7 mRNA表達情況

討 論

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，也是一種主要經(jīng)過淋巴系統(tǒng)轉移的惡性腫瘤。雖然近年來診斷和治療水平均有提高，但喉癌患者的5年生存率并無顯著改善［6］，腫瘤的局部復發(fā)、區(qū)域淋巴結轉移及遠處轉移是影響喉癌患者預后的主要因素。研究表明具有不同遺傳背景的惡性腫瘤細胞侵襲轉移的步驟基本相似，包括原發(fā)瘤生長、新生血管形成、腫瘤細胞脫落、血管或淋巴管轉移、轉移瘤形成等過程。近年來，國內外許多學者從不同的環(huán)節(jié)和角度探討癌細胞侵襲和轉移的發(fā)生機制，已證實血管生成參與腫瘤侵襲轉移的多個關鍵環(huán)節(jié)［7］:不僅原發(fā)瘤的生長依賴血管生成，癌細胞從原發(fā)灶脫落進入循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生轉移以及新的轉移灶生長也依賴血管生成。

EGFL7是血管管腔形成所必需的因子，其缺乏將導致管腔形成受阻，影響血管功能的完善。哺乳動物EGFL7基因屬于小基因家族，Soncin等［1］用EGFL7探針進行熒光原位雜交(FISH)染色顯示人類和小鼠的EGFL7基因分別定位于9號和2號染色體上，編碼一個相對分子量為30 kD的蛋白，發(fā)揮調節(jié)內皮細胞黏附、指導內皮細胞遷徙以及抑制血管平滑肌細胞遷徙的作用。

最初研究表明，EGFL7是胚胎發(fā)育血管形成過程中必不可少的因子［1］;隨后的研究證實，在人、小鼠及斑馬魚胚胎期和新生兒期的原始內皮細胞、各種血管內皮細胞及心內膜中均可檢測到EGFL7持續(xù)高水平表達［3］;而在幾乎所有成年個體的成熟組織中EGFL7均表達下調，在成年小鼠的一些富含血管的器官如肺臟、心臟和腎臟中有部分血管持續(xù)性表達EGFL7，可能與這些器官在出生后仍然有血管生成和改建有關;在一些增殖性組織，如腫瘤、血管損傷、妊娠期子宮及炎癥組織［8-9］中出現(xiàn)大量血管新生的現(xiàn)象，其EGFL7的表達呈明顯上調。我們研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中EGFL7表達較癌旁非腫瘤喉黏膜組織上調，且其表達水平與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移和預后有關，是喉癌預后的獨立預測因子［4］。然而，EGFL7究竟在喉癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮怎樣的功能，仍不清楚，因此本研究通過構建EGFL7基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)載體及穩(wěn)定干擾其表達的喉癌細胞克隆亞系，為今后進一步開展其功能研究奠定基礎。

RNAi是正常生物體內抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象［10］。隨著分子生物學技術的發(fā)展，RNAi被廣泛用于特定基因表達的抑制及“滅活”，成為研究特定基因功能的有效工具［11］。體內RNAi表達載體有質粒載體和病毒載體2種，其中病毒載體既能轉染分裂細胞，亦可轉染靜止細胞，既可以瞬時轉染也可以穩(wěn)定轉染、并且能提供高的轉染效率(接近100%)［12］，因此在實驗研究中得到廣泛應用。

目前主要有4種類型的病毒載體［13］:逆轉錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體、腺相關病毒載體和單純皰疹病毒載體。慢病毒載體是以HIV-1為基礎發(fā)展起來的基因治療載體。有別于一般的逆轉錄病毒載體，慢病毒載體是目前感染效率最高的載體，其又可分為整合型載體和非整合型載體兩種不同的類型。整合型慢病毒載體具有將目的基因整合至靶細胞基因組，可長期表達、免疫反應小等特點［14］?；诼《据d體的上述特點，我們采用復制缺陷型慢病毒作為人EGFL7基因RNAi的載體。

本研究通過生物信息學方法，針對人EGFL7基因序列，設計并合成4對EGFL7基因特異性干擾片段，構建并篩選出干擾效率最高的質粒，再與慢病毒載體進行重組，成功構建出EGFL7的RNAi慢病毒載體，病毒滴度達5×1011TU/L。pLenti6．3-EGFL7-miR病毒感染喉癌細胞HEp-2，經(jīng)BSD篩選2周得到穩(wěn)轉株，采用實時熒光定量PCR檢測顯示穩(wěn)定干擾EGFL7基因表達的HEp-2細胞與空白病毒穩(wěn)轉株細胞相比，EGFL7 mRNA表達下降了97%，干擾效果明顯。本研究中穩(wěn)定干擾EGFL7表達喉癌細胞亞系的建立為今后深入探討EGFL7蛋白的功能及其與喉癌發(fā)展發(fā)生的關系奠定了基礎。