馬文東， 袁 媛， 楊 奕， 徐 洪， 鄧海靜， 于婉瑩， 孫 月， 魏中秋， 楊 方△

(河北聯(lián)合大學(xué)1醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心，2教務(wù)處，3病理學(xué)教研室，河北唐山063000)

以往的研究認(rèn)為，在致肺纖維化各種刺激因素的作用下，肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖與合成大量細(xì)胞外基質(zhì)是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。然而近期的研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期受到致纖維化因素刺激時(shí)，肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞，會(huì)發(fā)生表型轉(zhuǎn)變并分化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast)。肌成纖維細(xì)胞能特異表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，被認(rèn)為是(矽)肺纖維化形成過程中產(chǎn)生過量細(xì)胞外基質(zhì)最主要和最重要的細(xì)胞［1-2］。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是研究最多、最為深入并誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化效果最為明顯的細(xì)胞因子之一［3-5］。近年來研究發(fā)現(xiàn)TGF-β介導(dǎo)的Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protien kinase，ROCK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在器官纖維化形成中發(fā)揮著重要作用［6］。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察與探討TGF-β1刺激誘導(dǎo)的RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)控肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化過程中的作用，為進(jìn)一步深入研究(矽)肺纖維化形成機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

材料和方法

1 肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

取新生Wistar大鼠，胰酶消化法獲得原代培養(yǎng)的肺成纖維細(xì)胞，取第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)前將細(xì)胞調(diào)整同步化后，實(shí)驗(yàn)被分為2部分:第1部分給予TGF-β1誘導(dǎo)刺激肺成纖維細(xì)胞0 min、5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 和 48 h。第2部分將細(xì)胞分為3組:(1)對(duì)照組:0．4%血清濃度的DMEM培養(yǎng)液;(2)TGF-β1誘導(dǎo)刺激組:0．4%血清濃度的 DMEM培養(yǎng)條件下，給予 TGF-β1(5μg/L)刺激后孵育細(xì)胞;(3)Y-27632干預(yù)組(Rho/ROCK通路阻滯劑組):為0．4%血清濃度的DMEM培養(yǎng)條件下，給予RhoA/ROCK通路特異性阻滯劑Y-27632(10 mg/L)預(yù)孵育1 h后，再給予TGF-β1(5μg/L)共同孵育，選擇誘導(dǎo)6 h、12 h和24 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

重組人 TGF-β1(Peprotech)、Y-27632(Cayman Chemica);GAPDH I抗(Santa Cruz)、β-actin I抗(Santa Cruz);I型、III型膠原 I抗(BA2023、BA0326，武漢博士德)、α-SMA I抗(Epitomics)、ROCK-I I抗(Epitomics)、血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)I抗(Santa Cruz);p-RhoA(Ser188)I抗(Affinity)、RhoA I抗(Affinity);肌球蛋白磷酸酶靶亞基(myosin phosphatase target subunit，MYPT;亦稱為myosin-binding subunit of myosin light chain phosphatase，MBS)I抗(Anbo);p-MBS(Thr850)I抗(Millipore)。

3 主要方法

3．1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)α-SMA在肺成纖維細(xì)胞的表達(dá) 常規(guī)制備細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定2 h。免疫細(xì)胞化學(xué)染色按說明書進(jìn)行，其中α-SMA抗體濃度為1∶200，DAB顯色。染色時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，PBS取代I抗。將染色后的細(xì)胞爬片經(jīng)IPP 7．0圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集。

3．2 Western blotting檢測(cè) ROCK、SFR、α-SMA、I型和III型膠原蛋白的表達(dá) RIPA蛋白裂解液裂解、離心，吸取上清。以考馬斯亮藍(lán)R-250染色測(cè)定蛋白濃度后，以每泳道50μg蛋白含量上樣，常規(guī)電泳并轉(zhuǎn)膜。5%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，在膜上滴加封閉液稀釋的抗大鼠的抗體(β-actin和GAPDH抗體1∶500稀釋;余抗體1∶100稀釋)，4℃孵育過夜。II抗(1∶3 000 稀釋)37 ℃孵育1 h。BCIP/NBT(1∶50稀釋)顯色。見有清晰條帶出現(xiàn)即用雙蒸水終止顯色。用掃描儀對(duì)PVDF膜上蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行圖像掃描，以ImageJ軟件對(duì)蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行平均吸光度值(average absorbance，A)的定量分析，經(jīng)內(nèi)參平衡(GAPDH或β-actin)后，以對(duì)照組的倍數(shù)作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean+SD)表示，用SPSS 13．0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TGF-β1誘導(dǎo)不同時(shí)點(diǎn) p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原蛋白表達(dá)的變化

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示(圖1)，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后大鼠肺成纖維細(xì)胞形態(tài)由未加刺激時(shí)的瘦長(zhǎng)梭形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閷挻?、多邊形，胞體內(nèi)出現(xiàn)大量平行或交叉排列的α-SMA抗體標(biāo)記的肌絲。其中誘導(dǎo)3 h即可見胞體內(nèi)肌絲，24 h幾乎所有的細(xì)胞胞體內(nèi)均有肌絲，細(xì)胞都轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞。Western blotting法結(jié)果顯示(圖2、表1)，經(jīng) TGF-β1分別刺激0 min、5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原蛋白表達(dá)均在刺激5 min后表達(dá)即開始上調(diào)。其中p-RhoA、ROCK和p-MBS蛋白多在6 h左右達(dá)到峰值，是誘導(dǎo)前的2倍左右;SRF蛋白在12 h達(dá)到峰值，是誘導(dǎo)前的4．55倍;α-SMA表達(dá)在24 h達(dá)到峰值，是誘導(dǎo)前的4．06倍;I型膠原蛋白和III型膠原蛋白表達(dá)在24 h達(dá)到峰值，分別為誘導(dǎo)前的2．19和3．04 倍。

Figure 1．The expression ofα-SMA in rat pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1 measured by immunocytochemistry(× 400)．Treatment with TGF-β1．A:0 min;B:3 h;C:6 h;D:12 h;E:24 h;F:48 h．The arrows indicate the positive expression ofα-SMA．圖1 TGF-β1刺激后肌絲樣結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化在大鼠肺成纖維細(xì)胞內(nèi)分布與表達(dá)情況

Figure 2．The expression of p-RhoA，ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts time-dependently induced by TGF-β1．圖2 TGF-β1誘導(dǎo)刺激不同時(shí)點(diǎn) p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原蛋白的表達(dá)

表1 TGF-β1誘導(dǎo)刺激不同時(shí)點(diǎn) p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原蛋白表達(dá)的變化Table 1．The expression of p-RhoA，ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts time-dependently induced by TGF-β1(Mean ± SD．n=3)

2 Y-27632 對(duì) TGF-β1誘導(dǎo) ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型膠原和III型膠原蛋白在細(xì)胞中表達(dá)的影響

Western blotting法結(jié)果顯示(圖 3、表 2)，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)6 h、12 h和24 h后，ROCK 表達(dá)增加，分別是相應(yīng)時(shí)點(diǎn)對(duì)照組的1．98倍、1．46倍和1．72倍。給予Y-27632預(yù)處理后，ROCK表達(dá)顯著下降，在6 h、12 h和24 h各時(shí)點(diǎn)分別是TGF-β1誘導(dǎo)組的48.48%、54．79% 和 50．62%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

TGF-β1誘導(dǎo)6 h、12 h 和24 h 后，p-MBS/t-MBS表達(dá)增加，分別是相應(yīng)時(shí)點(diǎn)對(duì)照組的2.25、2.78和1.95倍。給予Y-27632預(yù)處理后，p-MBS/t-MBS表達(dá)顯著下降，在6 h、12 h和24 h各時(shí)點(diǎn)分別是TGF-β1誘導(dǎo)組的64.00%、45.02%和54.86%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

TGF-β1誘導(dǎo)6 h、12 h和 24 h后，SRF 表達(dá)增加，分別是相應(yīng)時(shí)點(diǎn)對(duì)照組的2.01、2.76和2.62倍。給予Y-27632預(yù)處理后，SRF表達(dá)顯著下降，在6 h、12 h和 24 h各時(shí)點(diǎn)分別是 TGF-β1誘導(dǎo)組的60.70%、43.75%和33.20%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

TGF-β1誘導(dǎo)6 h、12 h 和24 h 后，α-SMA 表達(dá)增加分別是相應(yīng)時(shí)點(diǎn)對(duì)照組的1.48倍、1.53倍和2.13倍。給予Y-27632預(yù)處理后，α-SMA表達(dá)下降，在6 h、12 h和 24 h各時(shí)點(diǎn)分別是 TGF-β1誘導(dǎo)組的43.24%、59.18%和45.83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

經(jīng) TGF-β1誘導(dǎo)6 h、12 h 和24 h 后，I型膠原表達(dá)逐漸增加，分別是相應(yīng)時(shí)點(diǎn)對(duì)照組的1.83倍、1.64倍和1.89倍。給予Y-27632預(yù)處理后，I型膠原表達(dá)下降，在6 h、12 h和24 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)分別是TGF-β1誘導(dǎo)組的43.17%、56.29%和51.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)6 h、12 h和24 h后，III型膠原表達(dá)增加，分別是對(duì)照組的1.89倍、1.57倍和2.20倍。給予Y-27632預(yù)處理后，III型膠原表達(dá)下降，在6 h、12 h和24 h各時(shí)點(diǎn)分別是 TGF-β1誘導(dǎo)組的 60.32%、41.03% 和43.96%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

討 論

矽(塵)肺是由于長(zhǎng)期吸入含二氧化硅(SiO2)粉塵而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主要表現(xiàn)的疾病，其主要的病理學(xué)變化為肺間質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)(包括膠原蛋白)過多沉積導(dǎo)致肺的纖維化。在矽(塵)肺形成過程中，SiO2粉塵刺激肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子和活性物質(zhì)是矽肺纖維化發(fā)生的重要因素，其中TGF-β1是目前公認(rèn)的最為重要的致矽肺纖維化的因子之一［1-3］。體外研究也證實(shí)，采用SiO2刺激巨噬細(xì)胞或提取的灌塵老鼠肺泡灌洗液中的巨噬細(xì)胞，其培養(yǎng)上清 TGF-β1含量明顯增加，能夠顯著誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成，以及促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化［4-5］。而肌成纖維細(xì)胞其收縮、遷移和合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力與功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于肺間質(zhì)的成纖維細(xì)胞，是器官纖維化形成過程中產(chǎn)生過量細(xì)胞外基質(zhì)的最主要和最重要的細(xì)胞，在器官纖維化的發(fā)生與發(fā)展過程中具有重要意義［2-4］。Wang 等［7］報(bào)道，在大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎致腎小管間質(zhì)纖維化模型中，腎組織中TGF-β1、單核細(xì)胞趨化蛋白1、核因子κB和α-SMA的表達(dá)均較對(duì)照組(沒有進(jìn)行輸尿管結(jié)扎)明顯升高，腎小管間質(zhì)內(nèi)膠原的分布增多，膠原沉積增加。Peng等［8］應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)刺激人胚胎心臟成纖維細(xì)胞24 h后，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較明顯的α-SMA和胚胎型平滑肌肌球蛋白表達(dá)陽(yáng)性的肌絲結(jié)構(gòu)，其蛋白表達(dá)水平明顯增加，同時(shí)細(xì)胞合成、分泌的膠原含量升高。Lomas等［9］最近報(bào)道在人特發(fā)性肺纖維化患者肺組織纖維化聚集區(qū)，TGF-β1表達(dá)明顯升高，而α-SMA和I型膠原表達(dá)也明顯增加。認(rèn)為在特發(fā)性肺纖維化形成過程中，TGF-β1刺激間質(zhì)細(xì)胞的分化和膠原的合成與積聚密切相關(guān)。以往較多研究表明TGF-β1可以通過對(duì)Smad、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和蛋白激酶A等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)促進(jìn)靶器官間質(zhì)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化［8，10］。然而，近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠通過介導(dǎo)Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，調(diào)控肌成纖維細(xì)胞的分化。其可能的調(diào)節(jié)路徑為，TGF-β1通過其受體介導(dǎo)，激活靶細(xì)胞胞漿內(nèi)的Rho(也稱之small GTPase)，活化的Rho依次激活其下游的靶蛋白即ROCK，ROCK活化后抑制胞漿內(nèi)肌動(dòng)蛋白磷酸酶的活性，從而誘導(dǎo)了肌動(dòng)蛋白輕鏈的磷酸化和張力纖維的聚集，促進(jìn)了靶細(xì)胞α-SMA蛋白的表達(dá)和胞漿骨架蛋白的重構(gòu)［6，10-13］。SRF是 α-SMA上游的核轉(zhuǎn)錄因子，參與介導(dǎo)α-SMA表達(dá)的調(diào)控［10］。

Figure 3．Effects of Y-27632 on the expression of ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1．C:control;T:TGF-β1;Y:TGF-β1+Y-27632．圖3 Y-27632對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原表達(dá)的影響

表2 Y-27632對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型膠原和III型膠原蛋白表達(dá)的影響Table 2．Effects of Y-27632 on the expression of ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1(Mean ±SD．n=3)

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著 TGF-β1刺激細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，肺成纖維細(xì)胞開始由瘦長(zhǎng)梭形逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閷挻?、多邊形，?xì)胞表型發(fā)生了較明顯的轉(zhuǎn)變。當(dāng)誘導(dǎo)刺激3 h時(shí)，胞體內(nèi)可見明顯α-SMA抗體標(biāo)記的肌絲出現(xiàn)，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)平行與交叉排列的肌絲成分越來越多，當(dāng)誘導(dǎo)刺激24 h時(shí)，幾乎所有細(xì)胞胞體內(nèi)均有肌絲表達(dá)，即細(xì)胞均轉(zhuǎn)化為了肌成纖維細(xì)胞。

與對(duì)照組相比較，TGF-β1刺激后的細(xì)胞中RhoA/ROCK/p-MBS蛋白表達(dá)量顯著增多，在誘導(dǎo)刺激6 h左右，RhoA/ROCK相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)量就明顯上調(diào)。作為其下游效應(yīng)因子的核轉(zhuǎn)錄因子SRF蛋白的表達(dá)量也明顯增多，在12 h左右SRF蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值。同時(shí)，細(xì)胞中α-SMA蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間增加逐漸增多，I型和III型膠原蛋白的表達(dá)量也明顯增加，均在24 h達(dá)到峰值。這一過程似乎提示了TGF-β1誘導(dǎo)激活ROCK通路后，隨后活化SRF，并進(jìn)一步調(diào)控α-SMA的表達(dá)，刺激誘導(dǎo)了肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，進(jìn)而促進(jìn)I型和III型膠原蛋白的合成與表達(dá)。

當(dāng)給予ROCK通路特異性阻滯劑Y-27632干預(yù)后，ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA 以及 I型和 III型膠原蛋白的表達(dá)在各相應(yīng)時(shí)點(diǎn)均明顯減少。這提示ROCK通路特異性抑制劑Y-27632可以有效抑制這一過程，也從另一個(gè)方面證實(shí)了 TGF-β1介導(dǎo)的ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活對(duì)于調(diào)控肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化、促進(jìn)膠原蛋白合成、進(jìn)而促進(jìn)(矽)肺纖維化的形成具有重要的意義。