楊宇峰，滕 飛，石 巖

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032)

成功建立代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)動物模型是研究MS的基礎(chǔ)和必須。目前MS的基礎(chǔ)研究多選用大鼠MS模型，按照造模方法一般將MS鼠類模型分為三類，即遺傳型模型、喂養(yǎng)型模型和藥物型模型。喂養(yǎng)型模型主要是使用無特殊遺傳背景的大鼠為造模對象，并給予長期高熱量、高脂肪、高鹽等攝入誘導(dǎo)其表現(xiàn)出MS的相關(guān)臨床癥狀。因其比較穩(wěn)定可靠，且方法簡單易行、成本低、成模率高，廣泛應(yīng)用于MS實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)以期建立一種經(jīng)濟(jì)、可靠、易于操作、成模周期短、更適合用于研究MS機(jī)制的動物模型，同時考慮到多吃少動的現(xiàn)代生活方式所導(dǎo)致的肥胖是MS重要的致病因素［1］，通過喂飼大鼠高糖高脂飼料成功誘導(dǎo)大鼠MS的模型，為MS的發(fā)病機(jī)制研究提供了可靠的研究平臺。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，體質(zhì)量180±20g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供(動物合格證號 SCXK(遼)2004-0018)。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1d，自由飲水，無不良反應(yīng)及進(jìn)食、飲水和活動正常者納入實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

高脂飼料配方:2%膽固醇，丙硫氧嘧啶，20%砂糖，10%玉米油，8%蛋黃粉和60%基礎(chǔ)飼料混合而成。

1.3 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)自然采光，通風(fēng)良好，實(shí)驗(yàn)室全程保持室溫20±3.0℃，濕度40%，明暗周期12h。

1.4 主要試劑

人胰島素(INS，ELISA試劑盒:美國ADL公司，批號RT 110371)、膽固醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，編號69008214，批號 F20061011)。

1.5 主要儀器

電子天平(大連星海電子衡器有限公司MODELDS-671)，全自動生化分析儀(日本日立7600型)，TG16-WS臺式高速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，全自動血糖儀(強(qiáng)生穩(wěn)豪倍優(yōu)型)，數(shù)字體溫計(jì)(歐姆龍MC-612)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

按體質(zhì)量隨機(jī)分成空白對照組(n=10)和模型組(n=30)2組。

2.2 造模方法

單日喂食甘藍(lán)15～20g/只，自由飲水，游泳至耐力極限。雙日高糖高脂膳食持續(xù)喂養(yǎng)，共計(jì)12周。

2.3 脾氣虛證和代謝綜合征的評估標(biāo)準(zhǔn)

2.3.1 脾氣虛證的評估標(biāo)準(zhǔn) (1)體毛光亮度減退;(2)倦怠，懶動;(3)糞便時軟、時溏;(4)游泳耐力下降。

2.3.2 代謝綜合證的評估標(biāo)準(zhǔn) (1)體質(zhì)量增加;(2)空腹血糖增高;(3)血脂異常:空腹血TG增高及(或)HDL-C降低;(4)胰島素抵抗。具備以上4項(xiàng)組成成分中的3項(xiàng)或全部者即可診斷為MS成功模型。

2.4 標(biāo)本采集

標(biāo)本采集前禁食12h，空腹眶后靜脈取血，以3000r/min，4℃離心10min分離血清，分別送檢。

2.5 檢測項(xiàng)目和方法

2.5.1 一般觀察 體質(zhì)量(每2周測量1次)、行動、糞便、體毛光澤度等。

2.5.2 空腹血糖 采用全自動血糖儀測定。

2.5.3 甘油三脂和高密度脂蛋白 采用全自動生化分析儀測定。

2.5.4 空腹血清胰島素(FINS)采用酶聯(lián)免疫法。

2.5.5 胰島素敏感指數(shù)(ISI)采用李光偉［2］計(jì)算方法，以空腹血糖與空腹胰島素乘積倒數(shù)的自然對數(shù)來表示，即ISI=Ln1/(FPG·FINS)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用IBM SPSS Statistics 19軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組數(shù)據(jù)平均數(shù)之間的差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 基線情況

結(jié)果顯示，造模組與正常對照組在實(shí)驗(yàn)初始時在體質(zhì)量、血糖和血脂方面組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，基線水平齊。

表1 體質(zhì)量、空腹血糖及血脂基線情況(±s)

表1 體質(zhì)量、空腹血糖及血脂基線情況(±s)

注:與對照組比較:△P＞0.05

組 別 樣本量 體質(zhì)量(g)空腹血糖(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)高密度脂蛋白(mmol/L)對照組 10 168.8±10.23 5.92±1.52 0.89±0.46 1.21±0.15模型組 30 163.5±10.98△ 5.86±1.27△ 0.92±0.38△ 1.14±0.36△

3.2 一般狀況觀察

模型組從第2周后表現(xiàn)為食少懶動，體質(zhì)量增加，大便溏薄，異味重，精神萎靡不振，體毛光亮度減退，游泳耐力逐日下降。正常對照組體質(zhì)量逐日遞增，食欲好，活動正常，大便正常，背毛光澤，反應(yīng)靈活。

3.3 體質(zhì)量變化情況

表2 各組大鼠體質(zhì)量血糖的變化(±s)

表2 各組大鼠體質(zhì)量血糖的變化(±s)

注:與對照組比較:△P＜0.05。

項(xiàng)目 組 別 第2周 第4周 第6周 第8周 第10周 第12周體 質(zhì) 量(g)對照組 186.3±15.30 210.8±18.80 233.8±23.40 249.3±18.40 272.3±31.20△ 294.6±24.60△模型組 196.2±10.80 228.7±12.60△ 259.3±18.40△ 291.5±23.90 328.6±42.30 341.9±38.30血糖(mmol/L)對照組 6.14±11.13 5.76± 2.34 6.28± 3.56 6.64± 2.81 6.57± 3.15 6.61± 3.97模型組 6.93± 1.53 7.38± 2.77 8.86± 3.78△ 9.14± 5.38△10.61± 2.54△ 12.97± 6.35△

表2顯示，模型組大鼠體質(zhì)量與正常對照組比較逐漸增加，從第4周開始2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組大鼠空腹血糖與正常對照組比較明顯增加，從第6周開始2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.4 血脂變化情況

表3 各組大鼠空腹甘油三酯的變化(±s，mmol/L)

表3 各組大鼠空腹甘油三酯的變化(±s，mmol/L)

項(xiàng)目 組 別 造模后4周 造模后8周 造模后12周0.72±0.25 0.83±0.37 0.78±0.41模型組 1.84±0.22△ 1.88±0.67△ 1.96±0.48△高密度脂蛋白 對照組 1.08±0.73 1.16±0.20 1.19±0.68模型組 0.82±0.41△ 0.75±0.24△ 0.52±0.38甘 油 三 酯 對照組△

表3顯示，模型組大鼠甘油三酯與正常對照組比較明顯增加，2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組大鼠高密度脂蛋白與正常對照組比較明顯降低，2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.5 胰島素及胰島素敏感指數(shù)變化情況

表4 造模結(jié)束后各組大鼠血清胰島素及胰島素敏感指數(shù)情況

表4顯示，模型組大鼠血清胰島素與正常對照組比較顯著升高，2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，胰島素敏感指數(shù)顯著下降，2組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.6 模型復(fù)制總體情況

根據(jù)模型評估標(biāo)準(zhǔn)，因模型評估不達(dá)標(biāo)而剔除4只，并先后有2只大鼠死亡，尸體解剖沒有發(fā)現(xiàn)異常，推測可能與游泳后未及時將大鼠擦干，導(dǎo)致大鼠著涼、體質(zhì)減弱等有關(guān)。其余大鼠均符合成模標(biāo)準(zhǔn)，成模大鼠總共24只，成模率為80%。

4 討論

實(shí)驗(yàn)根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，以勞倦加飲食不節(jié)的復(fù)合因素，造成脾氣虛證MS模型。模型組出現(xiàn)了游泳耐力逐日下降，食少懶動，大便溏薄，精神萎靡不振，體毛光亮度減退，從第4周后體質(zhì)量開始顯著增加，第6周后空腹血糖增高，甘油三酯和高密度脂蛋白分別從第2周后表現(xiàn)出異常，造模結(jié)束后模型組出現(xiàn)高胰島素血癥、胰島素抵抗，符合本研究擬建立的脾氣虛證、代謝綜合證的評估標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)成功地復(fù)制與人類相似的脾氣虛證MS大鼠模型。

目前，有關(guān)高糖高脂飲食誘導(dǎo) MS模型的機(jī)制還不是很清楚。Pagliassotti MJ等［3］認(rèn)為，高糖可能造成體內(nèi)的氧化損傷，其促氧化效應(yīng)可引起血糖或葡萄糖耐量異常。同時高碳水化合物飲食可刺激肝臟脂肪的生成，提高血清中甘油三酯的水平，從而引起酯酰輔酶A的升高，升高的酯酰輔酶A增加了脂肪組織中飽和脂肪酸的含量，而脂肪組織中飽和脂肪酸與降低骨骼肌中胰島素的活動有關(guān)?？梢姡x的紊亂可影響糖代謝中胰島素的分泌，引起糖代謝紊亂。高糖飲食還可引起高胰島素血癥，并導(dǎo)致脂蛋脂酶活性的增高，對脂肪在體內(nèi)積累具有重要的作用，可引起皮下脂肪和腹腔內(nèi)脂肪積累［4，5］。Wilkes 等［6］認(rèn)為，高脂飲食直接降低胰島素作用下骨骼肌和脂肪組織對葡萄糖的吸收作用，同時提高肝臟葡萄糖的生成。因此，攝入高脂飲食會改變對胰島素敏感組織葡萄糖的轉(zhuǎn)變規(guī)律，從而導(dǎo)致整個機(jī)體糖代謝的紊亂。曹廷兵等［7］認(rèn)為，長期高脂飲食攝入可通過影響糖脂代謝和核受體基因參與血脂、胰島素抵抗的發(fā)生，通過影響炎癥相關(guān)基因、能量調(diào)節(jié)基因參與肥胖和高血壓的發(fā)生。上述基因改變可能是飲食介導(dǎo)MS發(fā)生的原因。游離脂肪酸(FFA)與 MS的發(fā)病有著密切關(guān)系［8］，高糖高脂飲食可能通過影響 FFA水平導(dǎo)致 MS發(fā)病，F(xiàn)FA濃度的升高通過特異性地阻斷胰島素的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)通路引起胰島素抵抗，還可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和血管反應(yīng)性的異常。

［1］沈成義，閆振成，祝之明.Wistar大鼠代謝綜合征動物模型的構(gòu)建及其特征分析［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22(6):526-529.

［2］李光偉.胰島素抵抗評估及其臨床應(yīng)用［J］.中華老年多器官疾病雜志，2004，3(1):11-12.

［3］PagliassottiMJ，PrachPA，KoppenhaferTA，etal.Changesin insulinaction，triglycerides，andlipidcompositionduringsucrose feedinginrats［J］.AmJPhysiol，1996，271:R1319-R1326.

［4］SCLATANI.The importance of taste and Palatability in carbohydrate-inducedovereatinginrat［J］.AmJPhysiol，1996，270:1197-1202.

［5］Marialuzfernandei.Differentialeffeetsofsimplesvs.complex carbohydratesonVLDLseretionratsandHDLmetabolisminthe guineaPig［J］.BiochBioPhyAeta，1995，1256:31-38.

［6］Wilkes，Arendbonen，RhondaC.Modifiedhigh-fatdietinduces insulinresistanceinratskeletalmusclebutnotadipocytes［J］.AmJPhysiol，275(4Pt1):E679-86.

［7］曹廷兵，閆振成，沈成義，等代謝綜合征大鼠模型的建立及其相關(guān)基因表達(dá)變化的研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2005，30(8):702-705.

［8］Terraubev， pendur， baruchd， etal. Increased metastatic potentialoftumorcellsinvonWillebrandfactor-de-ficientmice［J］.JournalofThrombosisandHaemostasis，2006，4:519-526.