姜春燕，譚 勇，呂 誠，李 立，李 健，張廣中，李元文，姜 淼，韓學(xué)杰，呂愛平△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，北京 100010;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體形態(tài)學(xué)系，北京 100029;4.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東方醫(yī)院皮膚科，北京 100078)

銀屑病俗稱牛皮癬，中醫(yī)古稱白疕，是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，屬于皮外科的疑難雜癥之一。臨床實踐證明，中醫(yī)辨證論治銀屑病能夠取得良好療效，而與西醫(yī)診治具有互補性。既往我們對銀屑病的中醫(yī)證候分類規(guī)律和用藥規(guī)律進行了探索，發(fā)現(xiàn)血熱證是銀屑病最常見的證型，生地黃是治療其最常用的中草藥［1］?；谖覀兗韧W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究基礎(chǔ)［2，3］，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，預(yù)測生地黃治療銀屑病的分子網(wǎng)絡(luò)機制，為探索中藥多靶點治療病證的機制研究提供方法學(xué)參考。

1 材料與方法

從中華人民共和國藥典(2005版)中查詢生地黃的有效成分，從美國國家衛(wèi)生研究所(NIH)建立的小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(http://pubchem.Ncbi.him.nih.gov)和基因數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)分別檢索生地黃各個有效成分對應(yīng)人類活性靶蛋白和銀屑病相關(guān)基因(檢索日期:2012年8月29日)，將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入IPA(Ingenuity Pathway Analysis)數(shù)據(jù)分析平臺，運行“core analysis”進行數(shù)據(jù)分析并得到相關(guān)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 生地黃靶蛋白及靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

表1顯示，通過檢索PubChem數(shù)據(jù)庫找到生地黃共有7個靶蛋白。通過IPA軟件構(gòu)建這些靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖1)。該網(wǎng)絡(luò)主要展示“與癌癥形成及細胞生長與死亡相關(guān)的分子”相互關(guān)系特征，提示這些靶蛋白參與癌癥形成及細胞生長與死亡的調(diào)控。

表1 生地黃靶標(biāo)蛋白

2.2 銀屑病相關(guān)基因生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)及功能

表2顯示，通過檢索 gene數(shù)據(jù)庫，共得到165個銀屑病相關(guān)基因。把這些基因?qū)隝PA軟件，共能構(gòu)建15個分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，這些分子主要涉及3個經(jīng)典通路，其中涉及銀屑病相關(guān)基因最多的是網(wǎng)絡(luò)(圖2)中的基因及核轉(zhuǎn)錄因子 κB(Nuclear Factor Kappa binding，NF-κB)信號通路(圖 4)中的相關(guān)基因。圖2主要展示“與皮膚炎癥、結(jié)締組織病變相關(guān)的分子”相互關(guān)系特征，提示這些基因參與皮膚炎癥、結(jié)締組織的調(diào)控。

圖1 生地黃靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與分子網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)通路

在IPA系統(tǒng)的Comparison功能中，比較銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的分子網(wǎng)絡(luò)及生物學(xué)通路。圖3顯示，腫瘤抑制蛋白(TP53)、核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子(TNF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP1)及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP2)是銀屑病和生地黃共同關(guān)聯(lián)的分子，提示生地黃可能主要通過調(diào)節(jié)這些分子對銀屑病發(fā)揮治療作用。圖4顯示，NF-κB信號通路是銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的生物學(xué)通路，但它們作用的靶點并不盡相同，提示生地黃靶蛋白GSK3B通過調(diào)控NF-κB信號通路對銀屑病發(fā)揮治療作用。

表2 銀屑病相關(guān)主要基因

圖2 銀屑病相關(guān)基因分子網(wǎng)絡(luò)

圖3 “生地黃靶蛋白-銀屑病相關(guān)基因”分子網(wǎng)絡(luò)

3 討論

蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein Interaction Network)是研究生物功能或病理變化分子基礎(chǔ)的新途徑和新方法，也是目前國際上生物信息學(xué)研究的熱點之一［4，5］。發(fā)現(xiàn)并建立與疾病相關(guān)的分子作用網(wǎng)絡(luò)，對于認識復(fù)雜疾病至關(guān)重要，也是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究所面臨的重大挑戰(zhàn)［6］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基本思路是理解疾病“表型-基因-靶點-藥物”相互作用的網(wǎng)絡(luò)特征，通過網(wǎng)絡(luò)分析觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，尋找可能的組合藥物靶標(biāo)，預(yù)測最優(yōu)化的組合藥物［2］?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)關(guān)鍵技術(shù)研究，對于預(yù)測藥效及藥理機制既是方法學(xué)創(chuàng)新，又具有重要的社會、經(jīng)濟效益［7］。許多復(fù)雜性疾病，如心血管疾病、腫瘤、糖尿病、銀屑病等是由多基因、多功能蛋白相互作用紊亂而形成的疾病網(wǎng)絡(luò)。中藥具有多成分、多靶點及系統(tǒng)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)功能特征，探索中藥對疾病的調(diào)控機制與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路有許多相似之處［8］。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法探索生地黃治療銀屑病的分子機制。

圖4 銀屑病相關(guān)基因及生地黃靶蛋白共同參與的NF-κB信號通路

PubChem數(shù)據(jù)庫和Gene數(shù)據(jù)庫是由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)建立的公共數(shù)據(jù)庫［9］。通過其中豐富的化合物、生物活性信息和疾病相關(guān)基因信息，以及數(shù)據(jù)庫自身對這些信息進行整合分析的功能，檢索生地黃有效成分靶蛋白和銀屑病相關(guān)基因作為我們構(gòu)建生地黃靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和銀屑病疾病網(wǎng)絡(luò)的分子基礎(chǔ)。IPA生物分析軟件能夠分析、整合、理解來自于基因表達等系統(tǒng)生物學(xué)、組學(xué)等的實驗數(shù)據(jù)，能夠搜索到有關(guān)基因、蛋白質(zhì)、化學(xué)品和藥物的信息，并能建立起實驗系統(tǒng)的交互模型［10］。在本研究中，我們除了利用IPA平臺構(gòu)建生地黃靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和銀屑病疾病網(wǎng)絡(luò)，同時利用 IPA軟件中Comparison Analysis的分析功能對這兩個網(wǎng)絡(luò)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)二者網(wǎng)絡(luò)的異同點以及二者生物學(xué)通路的異同點，進而尋找生地黃治療銀屑病的生物學(xué)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，生地黃可能主要通過調(diào)節(jié)TP53、NF-κB、TNF、MMP1 和 MMP2 五個分子，以及重組人糖原合成酶激酶3β(GSK3B)參與的 NF-κB信號通路對銀屑病發(fā)揮治療作用。TP53是調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡的重要蛋白［11］，能有效地調(diào)節(jié)表皮細胞的增殖周期，而銀屑病皮損中P53蛋白均表達異常［12，13］，調(diào)控機制失去平衡，成為表皮增殖紊亂的重要原因［14］。腫瘤壞死因子(TNF)基因是一種既能直接殺死腫瘤細胞，又能通過激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用的細胞因子。TNF-a出現(xiàn)在炎癥反應(yīng)初期，是機體炎癥與免疫反應(yīng)應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。TNF-α在銀屑病的發(fā)病機制中有著重要作用，是銀屑病炎癥反應(yīng)的始動因素［15，16］，參與銀屑病的啟動、維持和復(fù)發(fā)，且與浸潤的細胞成分及角質(zhì)形成細胞的增殖有關(guān)［17］。金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinase，MMPs)是一類結(jié)構(gòu)中含 Zn+和 Ca2+的蛋白水解酶類，是細胞外基質(zhì)和基底膜降解主要酶類之一。近年來有研究表明，MMPs是銀屑病的新生血管形成的重要因素，在銀屑病的發(fā)病中起重要作用［18，19］。NF-κB 是一種作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控眾多的細胞因子和炎癥介質(zhì)的基因表達，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，參與細胞內(nèi)信號傳遞，從而參與調(diào)節(jié)組織細胞的生理、病理反應(yīng)［20，21］。免疫介導(dǎo)是銀屑病的主要發(fā)生機制，銀屑病患者皮損區(qū)一些細胞因子及黏附分子表達異常，其中包括 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、TNF-α 和神經(jīng)生長因子(NGF)等［22］，而這些因子編碼基因的啟動子或增強子上都有NF-κB的結(jié)合位點。慢性銀屑病斑塊中 NF-κB活化缺陷與皮損的形成有關(guān)［23］。NF-κB p65 的異常表達與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)［24，25］。總之，銀屑病疾病位點和生地黃干預(yù)靶點都能體現(xiàn)在相同的分子網(wǎng)絡(luò)和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，干預(yù)這些分子網(wǎng)絡(luò)和通路中的相同或不同的關(guān)鍵分子，進而影響整個網(wǎng)絡(luò)或通路的生物學(xué)功能，這也許就是生地黃治療銀屑病的分子生物學(xué)機制之一。生地黃是治療血熱證銀屑病最主要的中草藥［1］，以藥測證，可以推斷上述生地黃的作用靶標(biāo)，也可能反映了血熱證的生物學(xué)特征。

總之，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為探索中藥治療疾證分子機制開辟了一條高通量途徑，為中藥有效成分篩選及探索效應(yīng)機制，進而為臨床用藥及新藥研發(fā)提供了新思路和新方法。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍處于起步發(fā)展階段，其研究手段、計算方法及應(yīng)用軟件還有待進一步探索，基于大量數(shù)據(jù)庫和算法構(gòu)建的分子網(wǎng)絡(luò)及藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)還需進一步實驗驗證［26］。

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