趙憲林，昝林森，田萬強，胡建宏，王韋華

(1.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100;2.渭南職業(yè)技術(shù)學院 農(nóng)學院，陜西 渭南 71400;3.楊凌職業(yè)技術(shù)學院 動物工程系，陜西 楊凌 712100)

奶牛性別控制技術(shù)是目前家畜繁殖新技術(shù)之一，應(yīng)用流式細胞儀進行X、Y精子分離已經(jīng)進入商業(yè)化生產(chǎn)階段[1]。與常規(guī)精液相比，性控精液在精子質(zhì)量及受精率方面還有不足之處[2-3]。在精液的冷凍-解凍過程中，精液的稀釋和體外處理等程序都會對精子造成一定的損傷，造成大量精子死亡并產(chǎn)生活性氧簇離子(ROS)，從而導致精漿中抗氧化酶類的活力降低，影響精液品質(zhì)。Aitken等[4]研究認為，ROS對精子的活力有極大的損害作用。ROS存在于精漿中，主要來源于芳香族氨基酸所催化死亡精子發(fā)生的反應(yīng)[5]。Flaherty等[6]在對人類的精液研究認為，ROS不但能降低精子的活力，而且能引起男性不育。在精液中含有多種抗氧化物酶，其主要功能是消除精液中過多的ROS，過多的ROS則可導致精子質(zhì)膜過氧化和DNA損傷，少量的ROS對于精子的獲能和頂體反應(yīng)是必須的[7]，因此精液精漿中的抗氧化物酶的活力大小與精子品質(zhì)和精子受精率有著密切的關(guān)系。雖然如此，關(guān)于性控精液品質(zhì)及常規(guī)精液抗氧化酶活性方面的研究對于奶牛性別控制非常重要，但性控精液精漿抗氧化酶類的變化研究還未見報道。

本研究旨在探討荷斯坦公牛性控精液和常規(guī)精液在活力、頂體完整率及精漿中四種抗氧化物酶類(ROS,GR,CAT,GSH)的活力差異，為性控精液的生產(chǎn)提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與試劑

主要儀器：流式細胞分離儀(MOFO-SX)、程控冷凍儀(法國卡蘇公司)、三相差熒光顯微鏡(NIKON公司)、離心機5810R (Eppendorf AG)、恒溫熱循環(huán)水浴鍋(sotemp 3028H)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH-B11·500型)，電熱鼓風干燥箱(HG101-2型)，電子分析天平(BS124S AG型)，細管一體機(法國，DIGITCOOL-5300型)，比色密度測定儀(RS-232型)。

主要試劑：果糖(天津石科密歐化學試劑開發(fā)中心)，檸檬酸鈉(天津市福晨化學試劑廠)，甘油(天津市化學試劑三廠)，慶大霉素(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責任公司)，林肯霉素(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責任公司)，壯觀霉素(sigma)。

1.2 精液稀釋液的制備

100 mL稀釋液：2.9 %檸檬酸鈉37 mL，12 %蔗糖液36.2 mL，卵黃20 mL，甘油6 mL。

上述稀釋液用磁力攪拌器攪拌30 min 以上，4 ℃冰箱內(nèi)過夜備用。在精液稀釋前加入慶大霉素1.3 mL，林肯霉素0.3 mL，壯觀霉素35 mg，磁力攪拌器攪拌10 min，再放入37.5 ℃水浴鍋中備用。

1.3 精液采集及分離

本次試驗地點是黑龍江大慶市大慶田豐生物技術(shù)有限公司。本試驗選擇年齡3～5歲，體質(zhì)健壯、繁殖性能良好的荷斯坦種公牛，采用假陰道法采精。精液采集后立即送至檢測室進行活力鑒定，活力大于0.65、密度大于1.5×109mL-1、且無異常氣味及顏色正常的精液視為合格精液。鑒定合格精液送染色室進行活體染色。染色后的精液樣品送至分離室，使用細胞流式儀進行X、Y精子分離。

1.4 精液冷凍

分離后的精液先在4 ℃環(huán)境中平衡90 min，再在添加VC的稀釋液中平衡10 min，離心，加稀釋液至目標濃度，然后用分裝機分裝，分裝好的精液放入4 ℃冰箱中平衡4 h。平衡后的稀釋精液，用分裝機吸入有標識的塑料細管內(nèi)并封口,然后把細管均勻擺放在細管金屬架上，然后將擺放細管的金屬架放入程控冷凍儀中進行程控降溫，當溫度降到-140 ℃時，細管投入液氮保存。

1.5 精液的解凍

從液氮中迅速取出3支凍精細管，立即投入38.5 ℃的溫水中解凍30 s，用于相關(guān)指標分析。

1.6 精子質(zhì)量及精漿中抗氧化物酶活力檢測

1.6.1 精子活力檢測 本次試驗精子活力由肉眼觀察進行測定[8]。

1.6.2 精子頂體完整率檢測 細管凍精解凍后，取細管中間的一滴精液于載玻片的左端，用另一張邊緣光滑的載玻片呈35°角自左端接觸液滴，拉向另一側(cè)，制成抹片。自然風干5～10 min后，用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15 min，水洗干燥后，用姬姆薩染色90 min，自來水沖洗，干燥，顯微鏡下觀察300個精子，統(tǒng)計頂體完整的精子數(shù)。

1.6.3 精漿酶活力測定 采用南京建成生物技術(shù)公司生產(chǎn)的酶活力測定試劑盒，按照試劑盒說明的操作規(guī)程測定精漿超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)四種酶活力。

1.7 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 13.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)精液與性控精液活力和頂體完整率比較

凍融后精子活力及頂體完整率的高低與精子受精率直接相關(guān)[8]。由表1可以看出，性控精液的精子活力比常規(guī)精液低5.33 %，與常規(guī)精液精子活率比較差異顯著(P<0.05)。性控精液的頂體完整率高出常規(guī)精液10.96 %，達到差異極顯著水平(P<0.01)。

表1 常規(guī)精液和性控精液活力和頂體完整率比較Table 1 Comparison of vitality and cone complete rate between normal semen and sexed semen

注:同行肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note:Different small letters in the same row mean significant difference between treatments(P<0.05)，the capital letter means extreme significant difference between treatments(P<0.01)．The same below.

2.2 常規(guī)精液與性控精液抗氧化物酶活力比較

凍融后的常規(guī)精液和性控精液精漿中抗氧化酶類的活力見表2。由表2可以看出，性控精液CAT值為0.73 U/mL，低于常規(guī)精液3.23 U/mL，與常規(guī)精液相比差異極顯著(P<0.01)。測定常規(guī)精液SOD值為1.27 U/mL，比性控精液高出0.70 U/mL，達到顯著差異(P<0.05)。常規(guī)精液GSH活力為117.51 U/mL，比性控精液高出41.73 U/mL，差異極顯著(P<0.01)。GR活力常規(guī)精液為75.59 U/mL，比性控精液高出61.26 U/mL，差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

本試驗結(jié)果表明，凍融后常規(guī)精液在活率方面顯著高于性控精液，但在頂體完整率方面性控精液顯著高于常規(guī)精液。在精漿中的抗氧化物酶類活力方面，性控精液凍融后其精漿中四種抗氧化物酶的活力都顯著低于常規(guī)精液。

表2 常規(guī)精液與性控精液精漿抗氧化物酶活力比較Table 2 Comparison of seminal plasma antioxidant enzyme activity between traditional semen and sexed semen

3.1 性控精液對精子活率和頂體完整率的影響

性控精液雖然可以控制家畜性別，為生產(chǎn)者帶來更大的經(jīng)濟效益，但是其受精率低一直是困擾其大面積推廣應(yīng)用的主要因素。性控精液凍后活率低是其受精率低的主要原因。造成性控精液活率低的原因可能是精子經(jīng)過復雜的程序處理，在進入冷凍程序之前處理時間太長，精子能量消耗較大，活力減弱。分離后活力弱的精子可能會在冷凍解凍過程中大量死亡，有效精子數(shù)減少，活率降低。頂體完整率和精子的受精率相關(guān)，頂體受損，導致頂體酶流失，使精子失去受精能力。但是本試驗表明，性控精液中的頂體完整率高于常規(guī)精液，原因可能是在分離的時候，大量的死精子被分離掉，使得原精中頂體破損并死亡的精子被除去。

3.2 性控精液對精漿中抗氧化物酶活性的影響

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物酶[12]，能還原對精子有毒害作用的過氧化物成為無毒的羥基化合物，同時促進H2O2的分解，從而保護精子細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。本次試驗證明性控精液的精漿中谷胱甘肽過氧化物酶極顯著常低于規(guī)精液差異，由此可以證明在性控精液的冷凍及解凍過程中，精液中存在較大量的ROS。在精漿中GR也能消除H2O2，GR在谷胱甘肽過氧化物酶的作用下，使H2O2還原成H2O。所以在冷凍精液中GR的活力的高低與精子的品質(zhì)也有很重要的關(guān)系。本試驗表明在性控精液中GR值顯著低于常規(guī)精液，則表明性控精液中極的精漿酶GR的活力低于常規(guī)精液。

綜上所述，在性控精液的精漿中四種抗氧化物酶類活力都顯著低于常規(guī)精液四種酶活力，活力低的原因可能是冷凍前對精液處理時間過長，導致精漿酶的值下降。也有可能是在精子活體染色的過程中，染料對GR的活力造成抑制，或者是精液稀釋液中缺乏對精漿酶起有效保護的物質(zhì)。由此可以表明，性控精液中的四種抗氧化酶類的活力值的高低與性控精液的品質(zhì)有很大關(guān)系，可能是造成受精率低的重要原因。研究開發(fā)性控精液高效稀釋液和冷凍保護劑，提高性控精液精子活力，保證精液抗氧化物酶活力是當務(wù)之急。

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