周 瓊 畢 蕾 顏曉靜 姜澤群 陳衛(wèi)平△

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

筆者前期的研究已初步探明了涼血化瘀方通過抗細胞凋亡保護肝細胞防治肝損傷［1］。本實驗將在此基礎(chǔ)上用D-氨基半乳糖（D-GalN）聯(lián)合內(nèi)毒素脂多糖（LPS）以仿造人類肝炎法建立大鼠急性肝損傷模型，觀察涼血化瘀方對肝細胞凋亡和線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）途徑相關(guān)蛋白的影響，進一步探討涼血化瘀方抗肝細胞凋亡的途徑和機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD健康雄性大鼠50只，體質(zhì)量200～250g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（滬）-2012-0002。

1.2 藥物 涼血化瘀方組成：赤芍、生地黃、制大黃。藥材購于安徽省亳州市藥材公司，由南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定。稱取赤芍300 g，生地黃200 g，制大黃200 g置不銹鋼鍋中加水3000 mL浸潤1 h，然后置電爐上加熱煎煮3次，煎煮時間分別為1h、40min、40 min，過濾合并濾液，濃縮成含生藥量1 g/mL，備用。使用時用0.9%氯化鈉注射液稀釋至所需濃度。按體表面積換算大鼠每日用量，等效量為 4506.5 mg/（kg·d），臨用前用蒸餾水配成所需濃度（低、中、高劑量分別為1/2、1、2 倍等效量）。

1.3 試劑及儀器 試劑D-GalN購自南京美好生物工程研究所，批號：110225。內(nèi)毒素LPS購自 Sigma公司，貨號為O127：B8。TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（FITC標(biāo)記POD法，石蠟切片專用）購自 Roche公司。兔抗大鼠 Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Chop 多克隆抗體和相應(yīng)二抗購自英國Abcam公司。β-actin購自CST公司。ECL發(fā)光試劑購自Pierce公司，其余試劑為分析純。儀器為OLYMPUS熒光多功能顯微鏡，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)。JEM-1010透射電鏡為JEDL公司生產(chǎn)。臺式高速冷凍離心機5810R型，Eppendorf公司。臺式低速離心機80-2型，上海醫(yī)療器械（集團）有限公司。電泳系統(tǒng)：Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司。圖像分析儀：CMIAS98A，北航。凝膠成像儀：GelDoc 2000 System，Bio-RAD 公司。

1.4 分組與造模 SD健康雄性大鼠50只，動物從1～50編號，采用SPSS12.0編程，隨機分成5組，正常對照組，模型組，涼血化瘀方高、中、低劑量組。末次給藥后1 h，除正常對照組外，其余4組按0.1 mL/10 g腹腔注射 GalN（50 mg/mL） +LPS（0.48 μg/mL），造成大鼠急性肝損傷模型。造模后6 h取肝組織檢測指標(biāo)（前期實驗表明造模6 h細胞凋亡率達高峰，以下各項實驗將參考此時間點設(shè)計指標(biāo)檢測時間）。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 （1）肝組織病理檢測。大鼠肝臟離體后經(jīng)10%甲醛固定、取材、脫水、浸蠟、包埋，再切成4 μm厚切片，HE染色，光鏡觀察，同時對肝組織病變程度作半定量分析。（2）電鏡觀察肝細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)。取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小肝組織置于戊二醛溶液（25 g／L）中固定，1%鋨酸后固定，超薄切片，電鏡下觀察肝細胞、細胞器的形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化，并注意觀察有無凋亡的典型形態(tài)學(xué)變化。（3）TUNEL細胞凋亡原位檢測。①常規(guī)石蠟組織切片的預(yù)處理后，進入標(biāo)記反應(yīng)。②陽性對照樣本的準(zhǔn)備：組織樣本在蛋白酶K處理、PBS浸洗后，再加入100 μL DNaseⅠ反應(yīng)液室溫37℃處理10～30 min。③陰性對照樣本的準(zhǔn)備：在標(biāo)記反應(yīng)制備TdT酶反應(yīng)液時，不添加TdT酶，其余步驟均相同。④標(biāo)記和顯色反應(yīng)：預(yù)處理好的樣本PBS漂洗兩次，樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本滴加50 μL TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片37℃避光濕潤反應(yīng)60 min（陰性對照片不加TdT酶），PBS漂洗3次，樣本周圍用吸水紙吸干，滴加50 μL Streptavidin-HRP工作液，加蓋玻片37℃濕潤避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗3次，滴加50～100 μL DAB工作液，室溫顯色反應(yīng)10 min，PBS漂洗3次，蘇木素常規(guī)染液復(fù)染。（4）Western blot檢測ERS 凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Chop。將少量組織塊置于勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中進行勻漿，用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，4℃裂解30 min后12000 r/min離心10 min，取上清即為總蛋白。以BCA法測定蛋白濃度后，取10 μg蛋白加上樣緩沖液，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)膜，然后用封閉液4℃封閉1 h，洗膜后加入適當(dāng)稀釋比例一抗抗體、孵育過夜，常規(guī)洗膜3次，繼而與二抗抗體室溫孵育2 h，常規(guī)洗膜，顯影，定影，讀取結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織病理學(xué)觀察 見表1。正常對照組肝臟由多邊行的肝小葉組成，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，中央靜脈無明顯充血，肝竇無擴張、充血，枯否氏細胞無增生，肝細胞無變性或壞死，胞漿內(nèi)有糖原空泡，與處死前禁食不好有關(guān)，門管區(qū)小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管無異常，間質(zhì)無炎細胞浸潤，無纖維組織增生。模型組與正常對照組相比，肝臟有點狀壞死，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)炎性細胞浸潤，系D-GalN+LPS造成肝臟損傷的典型表現(xiàn)。涼血化瘀方組變性壞死明顯減少，炎癥細胞數(shù)減少，肝組織的損傷修復(fù)程度較好，顯示了其對GalN+LPS所致大鼠急性肝損傷的抑制作用。

表1 各組病理半定量分析結(jié)果和凋亡細胞數(shù)比較（）

表1 各組病理半定量分析結(jié)果和凋亡細胞數(shù)比較（）

與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

2.2 電鏡觀察肝細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu) 電鏡觀察顯示，模型組肝細胞體積增大，細胞核型態(tài)不規(guī)則，核膜皺縮，并可見部分肝細胞呈凋亡樣改變，細胞體積明顯縮小，染色質(zhì)凝聚，見圖1-1；胞質(zhì)內(nèi)線粒體明顯腫脹，線粒體嵴稀疏，排列紊亂，基質(zhì)空泡化，可見有絮狀電子致密物出現(xiàn)，細胞質(zhì)內(nèi)可見較多次級溶酶體，見圖1-2。治療組肝細胞形態(tài)正常，細胞核呈圓形，線粒體無腫脹現(xiàn)象，但可見肝細胞內(nèi)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多，細胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴，見圖1-3、1-4。

2.3 TUNEL細胞凋亡原位檢測 見表1。各組隨機挑選6個視野，CMIAS98A圖像處理系統(tǒng)體視學(xué)圖像分析凋亡細胞數(shù)密度，計算公式如下：凋亡細胞數(shù)密度=棕色細胞數(shù)/細胞總面積×1000‰。各組凋亡細胞數(shù)密度分別為：模型組 6.23‰，正常對照組 1.45‰，涼血化瘀方高劑量組2.93‰，涼血化瘀方中劑量組2.62‰，涼血化瘀方低劑量組3.76‰。

圖1 各組肝細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)

2.4 Western blot檢測ERS凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Chop 見圖2。涼血化瘀方各劑量組凋亡標(biāo)志蛋白 Caspase-9、Caspase-3、Chop的表達下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調(diào)。

圖2 Western blot檢測ERS凋亡相關(guān)蛋白

3 討 論

內(nèi)毒素是觸發(fā)肝功能衰竭綜合癥的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［2］，可誘發(fā)肝細胞凋亡，繼而導(dǎo)致肝功能衰竭［3］。本實驗顯示，涼血化瘀方有保護大鼠肝損傷和抗肝細胞凋亡作用。

肝細胞凋亡是造成肝損傷和肝臟疾病基本的中心環(huán)節(jié)［4-5］。細胞凋亡發(fā)生機制主要涉及死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路、以線粒體誘導(dǎo)的內(nèi)源性通路及近年研究發(fā)現(xiàn)ERS啟動的凋亡途徑［6］。近期研究表明，ERS是線粒體應(yīng)激發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)［7］。筆者前期研究已顯示涼血化瘀方抗肝細胞凋亡作用，與死亡受體介導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因表達調(diào)控相關(guān)［8］，本實驗則從線粒體和ERS途徑進一步探討涼血化瘀方抗肝細胞凋亡的作用機制。

線粒體在肝細胞凋亡機制中已成為重要的研究對象，肝細胞損傷后線粒體功能障礙，膜通透性改變，凋亡蛋白包括Cyt-c、Caspase蛋白酶等從線粒體到胞漿，隨之引起 Caspase“瀑布式”活化和細胞死亡［9］。而 Bcl-2屬抑制細胞凋亡的家族成員之一，其可以與Cyt-c直接結(jié)合抑制Cyt-c的釋放，還能與Caspase-9和A-paf-1結(jié)合并固定于線粒體上從而阻止caspase級聯(lián)激活。本實驗研究顯示涼血化瘀方在下調(diào)Caspase-9、Caspase-3蛋白表達的同時，還能上調(diào)Bcl-2蛋白的上調(diào)，從而有效抑制肝細胞凋亡的發(fā)生，保護肝細胞。

Chop基因的激活轉(zhuǎn)錄則是ERS誘導(dǎo)凋亡的途徑之一［10］，持續(xù)的 ERS 誘發(fā)轉(zhuǎn)錄活化因子 4（ATF4）的翻譯進程，亦可引起Chop表達上調(diào)，促進細胞凋亡［11］。實驗中涼血化瘀方治療組肝細胞中Chop表達得以下調(diào)，說明其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡通路也有一定的作用。

綜上所述，Caspase-9是線粒體途徑細胞凋亡標(biāo)志蛋白之一，由Cyt-c激活，活化的Caspase-9再激活下游的效應(yīng)酶如Caspase-3等，進而誘發(fā)凋亡反應(yīng)。Chop是ERS誘導(dǎo)凋亡的主要調(diào)節(jié)蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細胞凋亡的發(fā)生具有特異相關(guān)性。Bcl-2是抑制細胞凋亡的調(diào)節(jié)蛋白，在線粒體和ERS途徑細胞凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果顯示涼血化瘀方對上述蛋白表達均有影響，提示其抗肝細胞凋亡作用與對線粒體和ERS途徑關(guān)鍵蛋白表達調(diào)控相關(guān)，而涼血化瘀方對ERS與線粒體途徑交互作用的調(diào)節(jié)機制尚需進一步深入研究。

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