綦惠，杰永生，陳磊，陶建峰，江建，孫磊

活動關(guān)節(jié)表面覆蓋的透明軟骨是一種低摩擦、富彈性、高滲透性的軟骨組織，對維持關(guān)節(jié)的運動功能具有重要意義。由于軟骨缺乏再生能力難以修復，外傷、腫瘤或骨性關(guān)節(jié)炎等原因造成的軟骨損傷，最終將導致關(guān)節(jié)面不完整，臨床上主要表現(xiàn)為頑固性疼痛，關(guān)節(jié)運動功能受限，需行關(guān)節(jié)融合術(shù)或關(guān)節(jié)置換術(shù)，較重的經(jīng)濟負擔與較長的術(shù)后恢復期嚴重影響患者生活質(zhì)量[1-4]。多年來，研究者和臨床醫(yī)生都在探索一種有效的修復方式。隨著生物技術(shù)、材料科學、免疫組織化學和分子生物學的發(fā)展，應用自體軟骨細胞移植技術(shù)（autologous chondrocyte implantation/transplantation，ACI 或 ACT）治療軟骨損傷已經(jīng)成為有效的方法[5-7]。支架的研究是自體軟骨細胞移植技術(shù)的重要課題。為了使支架保持良好的彈性、強度和穩(wěn)定性，交聯(lián)是必不可少的步驟之一[8-9]。我們試用兩種交聯(lián)劑對小牛真皮基質(zhì)來源的支架進行交聯(lián)，比較細胞毒性、生物相容性和間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在其表面的貼附效果，為制備可用于 ACI 技術(shù)的新型支架提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 新西蘭大白兔 1 只，雌雄不限，體重 2.5 kg，合格證號 SCSK（京）2010-0010；SPF 級 SD 大鼠 5 只，雌雄不限，體重 210～310 g，合格證號 SCXK（京）2012-0001，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。L929細胞由本單位細胞室提供。

1.1.2 主要試劑 脫毛劑、乙酸、SDS、PBS、戊二醛、水溶性交聯(lián)劑、苯酚等均為國產(chǎn)分析純，購自北京化工廠；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國 Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、Ficoll 細胞分離液等均購自美國 Sigma 公司。

1.1.3 儀器 C150 型細胞培養(yǎng)箱購自德國Binder 公司；CKX31 型倒置相差顯微鏡購自日本Olympus 公司；3-18KS 型低溫高速離心機購自美國 Sigma 公司；AdVantage 實驗型真空冷凍干燥機購自美國 Virtis 公司；680 型酶標儀購自美國Bio-Rad 公司；W4-1 型往復式真空泵購自上海益化真空設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脫細胞真皮的制備 將新生小牛背部皮膚于脫毛劑中 4 ℃ 浸泡 72 h，脫毛。清洗后，乙酸溶液中浸泡溶脹，切取厚度為 1～2 mm 的真皮層，流水沖洗，獲得真皮組織。室溫下，在水平振蕩器上應用 0.01% SDS 振蕩脫細胞，PBS 沖洗過夜，冷凍干燥機中凍干。脫細胞后的真皮基質(zhì)置于自配的消化液中，室溫下超聲 1.5 h，進行結(jié)構(gòu)改建。隨后用 PBS 沖洗，冷凍干燥機中凍干，初步獲得脫細胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）。

1.2.2 兩種交聯(lián)劑對真皮基質(zhì)進行交聯(lián) 將初步制備的脫細胞真皮基質(zhì)分為兩組，用不同的交聯(lián)劑進行交聯(lián)。分別將真皮基質(zhì)浸入 0.05% 戊二醛溶液和 0.2% 水溶性交聯(lián)劑中，室溫下浸泡 30 min。流水沖洗 48 h，蒸餾水清洗 20 次，于冷凍干燥機中凍干。將上述兩組分組裝袋封口，用60Co 250 萬rad 計量照射后備用。

1.2.3 細胞毒性檢測 根據(jù) GB/T 16175-2008 和GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5:1999 規(guī)定的方法進行材料的細胞毒性檢測。復蘇 L929 細胞，胰蛋白酶傳代至第三代，每孔 100 μl，濃度 4×104/ml鋪板。將材料浸提液 2 倍稀釋，陽性對照為 64 g/L苯酚溶液，陰性對照為細胞培養(yǎng)液。細胞貼壁 1、3、6 d 后（即第 2、4、7 天），加 DMSO 150 μl，振蕩 10 min。酶標儀上，490 nm 波長下測吸光度，取平均值。每孔加 MTT（5 g/L）20 μl，37 ℃，孵育 4 h，棄上層溶液，控干，每孔加 150 μl DMSO，混勻振蕩 10 min，陽性對照、陰性對照和稀釋后的材料浸提液各加 200 μl，于 490 nm 波長下測吸光度。按照公式：[（OD浸提液－ OD陽性對照）/（OD陰性對照－OD陽性對照）]× 100% 計算，數(shù)值 ≥ 100%，為 0 級，證明無任何細胞毒性，材料合格；數(shù)值在 75% ～99%，為 1 級，極低細胞毒性，材料合格；數(shù)值在50%～74%，為 2 級，低細胞毒性，根據(jù)材料的性質(zhì)做綜合分析；小于 50% 出現(xiàn)一次，即證實有細胞毒性，材料不合格。

1.2.4 溶血試驗 取 4 ml 新鮮兔抗凝全血中加入 5 ml 生理鹽水，制得稀釋的抗凝兔血 9 ml。實驗分為 4 組：①水溶性交聯(lián)劑組，以水溶性交聯(lián)劑制備的材料的浸提液稀釋 1 倍；②戊二醛組，以戊二醛作為交聯(lián)劑制備的材料的浸提液稀釋 1 倍；③陰性對照組（生理鹽水）；④陽性對照組（蒸餾水）。每組 3 個樣品，每試管放入稀釋后的抗凝兔血 0.2 ml，輕輕混勻后，37 ℃ 水浴 1 h。酶標儀 545 nm 測吸光度（OD545），3 個平行樣品吸光度取平均值計算實驗組溶血率，溶血率（%）=（OD實驗組–OD陰性對照）/（OD陽性對照–OD陰性對照）× 100%。

1.2.5 生物相容性檢測 SD 健康成年大鼠 5 只，麻醉后在無菌條件下，于大鼠脊柱兩側(cè)設(shè)計 2 個0.5 cm×1 cm 的長方形皮瓣，相互間隔為 1 cm，蒂部位于背部中間，掀起皮瓣，將消毒好的真皮基質(zhì)（0.5 cm×1 cm）分別植入大鼠皮下，將皮瓣覆蓋真皮，縫合。術(shù)后 4、8、12 周沿原切開口切開皮瓣，觀察真皮埋植物與周圍組織的關(guān)系；活檢取標本，HE 染色后在光鏡下進行組織學觀察。

1.2.6 孔隙率測定 材料置于一定體積（V1）的乙醇中，循環(huán)抽真空至無氣泡逸出，材料和乙醇的總體積記為 V2，將含乙醇的支架材料移出后所剩乙醇體積記為 V3，孔隙率可表示為：P =（V1–V3）/（V2–V3）× 100%。

1.2.7 細胞貼附效果檢測 新西蘭大白兔用戊巴比妥麻醉，髂嵴背側(cè)用骨髓穿刺針穿刺，取出套管針后，用注射器抽取骨髓（注射器內(nèi)裝肝素溶液），兩側(cè)各抽取 3 ml。吹打成細胞懸液，離心，用 Ficoll法分離細胞、洗滌及計數(shù)，以 2×105個/ml 的濃度將 MSCs 接種于消毒好的兩種材料上，入 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。電鏡觀察細胞貼附效果。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 脫細胞真皮交聯(lián)后的肉眼觀察

支架呈瓷白色，蓬松，表面有肉眼可見孔隙。兩種交聯(lián)劑交聯(lián)前后膠原支架的體積基本不變，均可較好地保持原有支架的形態(tài)。

2.2 細胞毒性檢測

兩種方法制備的支架材料，材料浸提液與 L929細胞作用后，細胞活性均明顯高于陽性對照，差異有顯著性，與陰性對照相比沒有顯著差異（表 1）。按照公式：[（OD浸提液–OD陽性對照）/（OD陰性對照–OD陽性對照）]× 100% 計算，數(shù)值均大于 75%，因此用本方法制備的載體合格。

2.3 溶血試驗

戊二醛作為交聯(lián)劑制備的支架材料的吸光度值明顯高于水溶性交聯(lián)劑制備的支架材料浸提液的吸光度值（P ＜ 0.05）（表 2）。經(jīng)計算，戊二醛組的溶血率為 4.61%，水溶性交聯(lián)劑組的溶血率為2.97% 均符合國標 GB/T-16886 小于 5% 的要求。

表1 MTT 法檢測細胞毒性（）Table1 Determination of cytotoxicity by MTT assay ()

表1 MTT 法檢測細胞毒性（）Table1 Determination of cytotoxicity by MTT assay ()

注：*與陽性對照組相比，P ＜ 0.05。Note: *Compared with positive control group, P ＜ 0.05.

組別Groups第 2 天The second day第 4 天The fourth day第 7 天The seventh day戊二醛交聯(lián)組 Cross-linked with glutaraldehyde 0.520 ± 0.051* 1.421 ± 0.036* 0.314 ± 0.025*水溶性交聯(lián)劑交聯(lián)組 Cross-linked with self-made cross-linking agent 0.499 ± 0.056* 1.515 ± 0.039* 0.307 ± 0.016*陰性對照組 Negative control 0.539 ± 0.047 1.378 ± 0.053 0.326 ± 0.008陽性對照組 Positive control 0.077 ± 0.008 0.069 ± 0.007 0.091 ± 0.002

表2 溶血試驗結(jié)果Table2 The results of hemolysis test

2.4 生物相容性比較

戊二醛交聯(lián) 4 周，植入物外周有輕度纖維包裹。可觀察到中性粒細胞、淋巴細胞、單核吞噬細胞等大量炎細胞浸潤，植入物內(nèi)未見出血或壞死（圖 1A）；8 周時，植入物外周有明顯纖維包裹，可觀察到淋巴細胞、單核吞噬細胞浸潤，有多處小面積出血壞死區(qū)（圖 1B）；12 周時，植入物外周有輕度纖維包裹，內(nèi)部有炎癥細胞浸潤，有大面積壞死和少量小血管長入（圖 1C）。而水溶性交聯(lián)劑交聯(lián)后的支架，生物相容性較好，僅見植入物外周有輕度纖維包裹，少量炎癥細胞浸潤，內(nèi)部未見出血或壞死，纖維包裹層的內(nèi)、外以及植入物內(nèi)均有小血管長入（圖 2）。

圖1 以戊二醛為交聯(lián)劑的支架大鼠皮下植入后的炎癥反應觀察（HE 染色，× 200）（A：4 周；B：8 周；C：12 周）Figure1 Biocompatibility test of the scaffold cross-linking with glutaraldehyde (HE staining,×200) (A: 4 weeks; B: 8 weeks; C:12 weeks)

圖2 水溶性交聯(lián)劑交聯(lián)支架大鼠皮下植入后的炎癥反應觀察（HE 染色，× 200）（A：4 周；B：8 周；C：12 周）Figure2 Biocompatibility test of the scaffold cross-linking with cross-linking agent (HE staining,×200) (A: 4 weeks; B: 8 weeks;C: 12 weeks)

2.5 孔隙率測定

水溶性交聯(lián)劑制備的支架材料，三次測定孔隙率分別為 85%、79%、89%，以來表示為84.3% ± 5.0%；戊二醛制備的支架材料，三次測定孔隙率分別為 92%、72%、75%，以來表示為 79.7% ± 10.8%，兩者比較，P ＞ 0.05，差異不具有統(tǒng)計學意義。

2.6 細胞貼附效果觀察

電鏡觀察，戊二醛和水溶性交聯(lián)劑交聯(lián)制備的支架材料相比，前者的孔隙略小于后者，整體上的孔隙相差不大（圖 3）。MSCs 在支架上的貼附比較，前者 MSCs 貼附較少，僅在部分區(qū)域發(fā)現(xiàn)細胞貼附（圖 4A）；后者可見 MSCs 成大片狀貼附在材料表面，觀察到微絨毛和分泌情況（圖 4B）。

3 討論

如何有效地修復關(guān)節(jié)軟骨缺損并最大限度恢復其功能一直是關(guān)節(jié)外科研究的熱點[1-4]。ACI 技術(shù)的出現(xiàn)為修復軟骨損傷開辟了一條新的道路[5-7]。合適的支架和種子細胞是其中的兩個重要條件。

支架的制備是 ACI 技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。膠原作為一種天然生物支架，因其生物相容性好、與細胞親和力高、抗原性低、生物可降解性好、拉伸強度高等優(yōu)良性質(zhì)，成為組織工程中應用最廣泛的生物支架之一。脫細胞真皮基質(zhì)的主要成分是 I 型或I/III 型膠原，目前臨床上主要用于腭部修復、乳腺重建、鼻部重建以及燒傷后皮膚的重建等[10-11]。

圖3 未貼附細胞時，支架的電鏡觀察（× 500）（A：戊二醛交聯(lián)；B：水溶性交聯(lián)劑交聯(lián)）Figure3 Scaffold without cells (× 500) (A: Cross-linking with glutaraldehyde; B: Cross-linking with cross-linking agent)

圖4 貼附細胞后，支架的電鏡觀察（× 500）（A：戊二醛交聯(lián)；B：水溶性交聯(lián)劑交聯(lián)）Figure4 Scaffold with mesenchymal stem cells (× 500) (A: Cross-linking with glutaraldehyde; B: Cross-linking with cross-linking agent)

本研究小組自 2003年開始進行 ADM 作為軟骨修復支架的研究。經(jīng)過脫毛-脫細胞-結(jié)構(gòu)改建的真皮組織已經(jīng)初步具備了作為軟骨細胞移植支架的特點，但彈性、強度以及體內(nèi)的穩(wěn)定性仍然較差，需進行交聯(lián)。戊二醛作為一種常用的交聯(lián)劑成為首選。根據(jù) GB/T 16175-2008GB/T 和 16886.5-2003/ISO 10993-5:1999 規(guī)定的方法，戊二醛交聯(lián)的支架經(jīng)細胞毒性檢測均合格可以用于后續(xù)實驗。溶血試驗也提示，符合 GB/T-16886 要求的小于 5%。但是植入大鼠背部皮膚后，炎細胞浸潤、纖維包裹、強烈炎癥反應持續(xù)存在 12 周，體內(nèi)生物相容性明顯不佳，可能與戊二醛在支架上的殘留較難清除干凈有關(guān)。強烈的炎癥反應不利于支架本身促進軟骨修復功能的發(fā)揮。因此我們試用一種新的水溶性交聯(lián)劑，該交聯(lián)劑本身分子上的基團可以與真皮組織中（主要成分為膠原）的氨基發(fā)生縮合，使原有結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，能夠形成網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)，使結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。同時，應用新型交聯(lián)劑制備的支架與使用戊二醛作為交聯(lián)劑制備的支架相比，細胞毒性檢測合格，溶血率為 2.97%，符合國標要求。而且，植入大鼠背部皮膚直至 12 周僅發(fā)生輕微的炎癥反應，炎細胞輕度浸潤，纖維包裹不嚴重，并有小血管長入，提示該交聯(lián)劑制備的支架生物相容性明顯優(yōu)于戊二醛制備的支架。經(jīng)排液法粗測孔隙率，兩種方法制備的支架，孔隙率相差不大。電鏡下觀察，兩種交聯(lián)劑處理均較好地保持了支架的特性，支架立體感強，纖維排布均勻，水溶性交聯(lián)劑處理的支架表面的孔隙比戊二醛處理之后的支架孔隙大，具體數(shù)據(jù)還有待進一步測定。

具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞是具有前途的軟骨組織工程種子細胞[12-13]。采用家兔的MSCs 進行細胞貼附實驗，為后續(xù)的軟骨損傷動物模型的在體實驗做準備。MSCs 在水溶性交聯(lián)劑處理的支架上貼附良好，細胞平鋪在支架表面，有微絨毛和分泌現(xiàn)象，表明細胞狀態(tài)較好，具有正常功能。戊二醛處理之后的支架材料，盡管結(jié)構(gòu)亦較為滿意，但細胞貼附情況不佳，僅有少量細胞貼附在材料表面，可能與戊二醛殘留對細胞的不利影響有關(guān)。

理想的軟骨組織工程支架應具有以下條件：首先，應具有良好的生物相容性，無毒、無致畸；第二，表面活性有利于細胞的貼附，并為細胞在其表面生長、增殖和分泌基質(zhì)提供良好的微環(huán)境；第三，具有一定的可塑性，便于加工成所需的形狀，并有一定的機械強度，植入體內(nèi)一定時間內(nèi)仍可保持其形狀；第四，基質(zhì)材料應具有多孔性和高孔隙率，內(nèi)表面積大，既有利于細胞的貼附和長入，又有利于營養(yǎng)成分的滲入和代謝產(chǎn)物的排出。后續(xù)實驗中，擬將支架或者支架-細胞復合體植入關(guān)節(jié)軟骨損傷動物的膝關(guān)節(jié)，將整個膝關(guān)節(jié)取下，與正常關(guān)節(jié)的抗壓縮、抗拉伸以及彈性模量等生物力學特性進行比較，分析材料植入之后對關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復情況。在體動物試驗中，將檢測不同時間段軟骨損傷修復情況，分析支架的植入是否有利于軟骨損傷的修復以及修復后膝關(guān)節(jié)功能（包括生物力學特性），以判斷采用水溶性交聯(lián)劑制備的軟骨修復支架能否良好地修復軟骨缺損，能否成為 ACI 技術(shù)中一種理想的支架。

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