李高輝，康可人，黎鋒，袁玉亮，王繼華

感染個(gè)體進(jìn)行 HIV 抗體的檢測對 HIV 的診斷和控制至關(guān)重要，傳統(tǒng)的血液檢測法對醫(yī)院的環(huán)境設(shè)施及相關(guān)醫(yī)務(wù)人員水平的要求較高，也存在交叉感染的危險(xiǎn)。研究表明，HIV 感染者的唾液或口腔黏膜滲出液中幾乎不含 HIV 病毒，但含有抗 HIV 抗體，并且檢出率高。這一發(fā)現(xiàn)為艾滋病檢測提供了一個(gè)全新的發(fā)展方向[1-2]。在以口腔分泌物為樣本的 HIV 抗體診斷試劑研發(fā)領(lǐng)域，雖然國內(nèi)外曾有報(bào)道，但國內(nèi)至今可成熟應(yīng)用到臨床檢測的試劑非常少見。本研究通過工藝摸索及優(yōu)化，建立了一種基于口腔黏膜滲出液樣本檢測 HIV1/2 型抗體的診斷方法（免疫分析法），為臨床提供了適用于 HIV 抗體檢測的安全、無創(chuàng)、快速診斷試劑。研制的檢測試劑可廣泛用于高危人群的流行病學(xué)調(diào)查和監(jiān)測，對推進(jìn)社區(qū)醫(yī)療和家庭 POCT（point of care testing）在傳染病診斷領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 氯金酸購自上海試五化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸三鈉購自廣州化學(xué)試劑二廠；牛血清白蛋白（BSA）購自美國 Sigma 公司；HIV gp36、HIV gp41 基因重組抗原由本實(shí)驗(yàn)室制備；羊抗兔 IgG 多克隆抗體、鼠抗人 IgG 多克隆抗體、兔 IgG 均購自美國 Meridian Life Science 公司；人類免疫缺陷病毒（HIV1/2）抗體免疫印跡試劑盒為新加坡 MP 生物醫(yī)學(xué)亞太有限公司產(chǎn)品[批準(zhǔn)文號：國食藥監(jiān)械（進(jìn)）字 2008 第 3403441 號；批號：AE9009]；人類免疫缺陷病毒抗體（HIV1/2）診斷試劑盒（血清血漿膠體金法）為廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品[批準(zhǔn)文號：國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字 2010年 3400840 號；批號：W0620103C]；硝酸纖維素膜、Milli-Q Advantage A10超純水儀購自美國 Millipore 公司；玻璃纖維購自上海尚卓過濾設(shè)備有限公司；NanoDrop 2000C 分光光度計(jì)為美國Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)為日本 Hitach 產(chǎn)品；接觸式噴膜機(jī)為美國 Imagene Technology 公司產(chǎn)品；BHC-1300IIB2 生物安全柜為蘇凈安泰公司產(chǎn)品。

1.1.2 參考品

⑴標(biāo)準(zhǔn)參考盤（質(zhì)控品）：Anti-HIV1/2 Combo Performance Panel PRZ207 由美國 SeraCare Life Science公司提供。由 15 支樣品組成，其中 7 支 HIV-1 陽性參考品，7 支 HIV-2 陽性參考品，1 支陰性參考品（Lot：116839）。

⑵ HIV 抗體參考品（唾液快速試劑）：由中國藥品生物制品檢定所提供。由 46 支樣品組成，其中 20 支陽性參考品，20 支陰性參考品，5 支靈敏度（最低檢出限）參考品，1 支精密度參考品（Lot：20050415-01）。

⑶ HIV 抗體唾液檢測企業(yè)參考品：由廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司提供。由 46 支樣品組成，其中 20 支 HIV抗體陰性參考品，18 支 HIV-1 抗體陽性參考品，2 支HIV-2 抗體陽性參考品，5 支抗 HIV-1 型 gp160 抗體最低檢出限參考品，1 支 HIV-1 型精密性樣品（Lot：110715）。

1.1.3 臨床樣本來源 陽性樣本 212 例，由廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心采集（時(shí)間跨度為 2008年 12月至2011年 5月期間 HIV 確診患者），HIV 陽性樣本均符合世界衛(wèi)生組織艾滋病的監(jiān)測診斷標(biāo)準(zhǔn)。陰性樣本 500 例，為隨機(jī)健康體檢人群，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)檢驗(yàn)科及廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司采集。唾液采集時(shí)，用口腔拭子的采樣端沿著受試者的上、下齒齦輕輕擦拭，翻轉(zhuǎn)口腔拭子幾次后，將拭子裝入有處理液的樣本試管內(nèi)，采樣端的兩面緊貼試管壁刮擦若干次，從提取管中取出拭子，試管內(nèi)樣本即可用于測試。采集口腔黏膜滲出液樣本同時(shí)平行采集上述人員的血液標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 試劑工藝體系建立及優(yōu)化

1.2.1.1 固相化工藝體系的建立優(yōu)化 0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）作為包被溶液稀釋抗原、抗體。分別取 0.8、1.2、1.5 mg/ml 3 種濃度的 HIV gp41 和 gp36 基因重組抗原，在硝酸纖維膜上制備檢測線（T 線）；分別取 1.0、1.5、2.0 mg/ml 3 種濃度的羊抗兔 IgG 多克隆抗體，在硝酸纖維膜上制備質(zhì)控線（C 線）。選取最合適的濃度參數(shù)進(jìn)行試劑的包被膜制備。

1.2.1.2 標(biāo)記工藝體系建立及優(yōu)化 將氯金酸配制成0.01% 水溶液，取 100 ml 加熱至沸騰，邊攪動邊加入 1%檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱煮沸 15 min，待溶液逐漸穩(wěn)定成紅色后，停止加熱冷卻至室溫，用蒸餾水恢復(fù)至原體積。用 0.1 mol/L 碳酸鉀調(diào)氯金酸溶液 pH 到 7.0～7.5，將鼠抗人 IgG 及兔 IgG 分別按 10 μg/ml 和 20 μg/ml 濃度蛋白溶液加入溶液中，混勻，靜置 30 min，8500 r/min 離心50 min，沉淀用含 BSA 的緩沖液懸浮，洗滌 2～4 次，以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，將以上氯金酸顆粒結(jié)合物稀釋至使用濃度，均勻涂布在玻璃纖維上制備蛋白標(biāo)記墊，置于 30 ～40 ℃ 室內(nèi)干燥 12 h。選取最合適的蛋白濃度參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記墊的制備。

1.2.1.3 唾液緩沖體系的建立及優(yōu)化 唾液緩沖體系在檢測實(shí)現(xiàn)過程中除了提供緩沖外，能有效減少口腔分泌物雜蛋白或者活性酶的干擾反應(yīng)。根據(jù)已有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，緩沖體系以 ISO/TR10217 標(biāo)準(zhǔn)人工唾液為配方進(jìn)行優(yōu)化，配制成含有氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫化鈉、尿素及牛血清白蛋白的緩沖體系。

1.2.1.4 根據(jù)最佳的包被及標(biāo)記工藝參數(shù)制備包被膜及標(biāo)記墊。將包被膜、標(biāo)記墊與樣品墊粘貼成板，切成條，制備試劑條。

1.2.2 試劑性能評估 陽性參考盤符合率：分別用試劑檢測陽性參考品，檢測結(jié)果應(yīng)符合參考品的要求；陰性參考盤符合率：分別用試劑檢測陰性參考品，檢測結(jié)果應(yīng)符合參考品的要求；最低檢出限（靈敏度）：分別用試劑檢測最低檢出限參考品，檢測結(jié)果應(yīng)符合參考品的檢測要求；精密性：對 1 份精密性參考品平行測定 10 次，結(jié)果應(yīng)符合要求，顯色均一。

1.2.3 臨床應(yīng)用驗(yàn)證

1.2.3.1 用制備的 HIV1/2 口腔黏膜滲出液檢測試劑（免疫層析法）和 HIV1/2 抗體（血清血漿）快速檢測試劑分別平行檢測 212 例 HIV 陽性患者并與免疫印跡法的結(jié)果比對，比較試劑符合率。

1.2.3.2 用制備的 HIV1/2 口腔黏膜滲出液檢測試劑（免疫層析法）和 HIV1/2 抗體（血清血漿）快速檢測試劑分別平行檢測 500 例 HIV 隨機(jī)陰性人群口腔黏膜滲出液和血液樣本；進(jìn)行試劑符合率比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 Microsoft Excel 2000 軟件對數(shù)據(jù)記錄、處理和作圖。配對卡方檢驗(yàn)采用 SPSS 軟件進(jìn)行，P ＜ 0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 試劑工藝確定

通過梯度實(shí)驗(yàn)，最終選取濃度為 1.5 mg/ml 的 HIV gp41 蛋白和 gp36 蛋白包被硝酸纖維素膜制備 T 線；2.0 mg/ml 濃度的羊抗兔 IgG 多克隆抗體包被硝酸纖維膜上制備 C 線。選取 20% 稀釋比例濃度稀釋鼠抗人 IgG 及兔 IgG 的氯金酸結(jié)合物，制備標(biāo)記墊，將硝酸纖維膜與標(biāo)記墊分別置于溫度 30℃ ± 5℃，濕度 10%～30% 的環(huán)境下干燥 12 h。組裝成大板，用切條機(jī)切成 4.0 mm 的條，裝入外盒，制成免疫層析檢測試劑成品。

2.2 試劑性能評估

用制備的 HIV1/2 口腔黏膜滲出液檢測試劑分別檢測國際參考盤 Anti-HIV1/2 Combo Performance Panel、國家HIV 抗體參考品和企業(yè)參考品，檢測結(jié)果表明研制試劑的靈敏度、特異性、精密度三項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。國際參考盤中的 HIV-1 型及 2 型共 14 支陽性樣本檢測均為陽性結(jié)果，符合率達(dá)到 100%。國家參考盤中的 HIV-1 型的 18 支陽性樣本及 2 支 HIV-2 型樣本檢測結(jié)果均為陽性結(jié)果。特異性指標(biāo)結(jié)果顯示，試劑檢測國家參考盤和企業(yè)參考盤的陰性參考品共 40 支，無假陽出現(xiàn)，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品對特異性指標(biāo)的要求，陰性符合率為 100%（20/20），符合標(biāo)準(zhǔn)要求的大于 90%（18/20）。結(jié)果見表 1。

2.3 臨床樣品唾液快速檢測的結(jié)果

采用研制的 HIV1/2 口腔黏膜滲出液檢測試劑和對照HIV 血清血漿檢測試劑分別檢測 712 例樣本。臨床結(jié)果顯示，口腔黏膜滲出液檢測試劑與對照 HIV 血清血漿檢測試劑陽性符合率為 210/213 = 98.59%；陰性符合率為499/499 = 100%；總符合率為（210 + 499）/（213 + 499）=99.58%。兩種方法比較，無顯著差異性（P ＞ 0.05）。212 例經(jīng)免疫印跡檢測確認(rèn)為陽性結(jié)果的樣本中，研制試劑檢出210 例，與免疫印跡檢測試劑陽性相符率為 210/212 =99.06%。在對比試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，研制的 HIV1/2 口腔黏膜滲出液檢測試劑在臨床檢測結(jié)果比以血液為樣本的快速篩查試劑總符合率高，參照免疫印跡法的結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，對某些低值陽性樣本研制的口腔黏膜滲出液檢測試劑較血液快速檢測試劑更為靈敏（數(shù)據(jù)未公布），這與唾液檢測系統(tǒng)的工藝體系直接相關(guān)，可見以口腔黏膜滲出液為樣本的檢測模式在應(yīng)用中更為方便、快捷、準(zhǔn)確。

表1 參考盤的檢測結(jié)果

3 討論

人體口腔分泌的唾液中主要成分為水，其次含有少量唾液淀粉酶、黏多糖、黏蛋白及某些無機(jī)物。研究表明，唾液成分變化同樣反映疾病及健康狀況，已逐漸成為取代血液或尿液的檢測樣本，在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域被廣泛研究和運(yùn)用[3-6]。

HIV 抗體檢測，是艾滋病病毒檢測一直沿用的基本檢測方法[1]，包括酶聯(lián)免疫吸附法、側(cè)向免疫層析法和免疫印跡法。但成熟的抗體篩查試劑仍然以血清、血漿及全血樣本為主，唾液或口腔黏膜滲出液不多見。以口腔黏膜滲出液為樣本的 HIV 抗體快速診斷試劑目前國內(nèi)未見有廠家研制及規(guī)?；a(chǎn)，全球各大診斷試劑廠家在 HIV 檢測領(lǐng)域也頗為關(guān)注[7]。本研究制備的口腔黏膜滲出液 HIV1/2 型抗體檢測試劑是將抗原抗體的反應(yīng)與側(cè)向?qū)游鲈硐嘟Y(jié)合，通過實(shí)現(xiàn)固相化工藝及蛋白標(biāo)記工藝的突破，實(shí)現(xiàn) HIV 抗體快速檢測技術(shù)的又一次提升。本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的 HIV 口腔黏膜滲出液檢測試劑，通過檢測不同來源的參考盤，驗(yàn)證其靈敏度、特異性、精密度均符合要求。檢測 712 份臨床樣本的數(shù)據(jù)表明，研制的試劑與商品化的 HIV 抗體檢測試劑有較高的總符合率，達(dá)到 99.58%。與免疫印跡法比較，兩者陽性符合率為 99.06%。

綜上所述，本研究成功建立了以口腔黏膜分泌物為檢測樣本的非侵入性 HIV 快速檢測方法及試劑，研制的試劑盒作為一種快速、簡便、準(zhǔn)確、無創(chuàng)的診斷方法適用于大規(guī)模人群的現(xiàn)場檢測及家庭自測，尤其適用于醫(yī)療條件有限、采血困難的邊遠(yuǎn)地區(qū)及兒童、肥胖者、靜脈萎縮者等不易于靜脈采血人群的檢測，為艾滋病的有效防控及治療評價(jià)提供了更為快捷、便利的新手段和工具。

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