湯蘇陽(yáng)，李彥，閆俊靈，陳沖，李梁，丁紅，原理

尋找安全、有效、無(wú)毒、持久的組織代用品是修復(fù)重建外科亟待解決的問題。自 20 世紀(jì) 70年代開展自體脂肪移植以來，移植后脂肪的吸收、液化、壞死、感染、纖維囊性化和假性囊腫等不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響了脂肪移植的發(fā)展。提高脂肪移植成活率、降低脂肪移植后的并發(fā)癥是自體脂肪移植技術(shù)的關(guān)鍵[1]。本研究通過自體脂肪干細(xì)胞（human adipose stem cells，hADSCs）體外擴(kuò)增混合自體脂肪顆粒移植的方法進(jìn)行面部美容充填和隆胸，6 ～24 個(gè)月后進(jìn)行隨訪研究，比較單純自體脂肪移植與 hADSC 體外擴(kuò)增混合自體脂肪顆粒移植的效果，探討體外擴(kuò)增的 hADSC 是否能提高自體脂肪移植的成活率、降低脂肪移植后并發(fā)癥且有較好的美容成形效果。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象與材料

1.1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組納入對(duì)象 50 例，女性46 例，男性 4 例，年齡 23～60 歲，健康狀況良好，無(wú)其他系統(tǒng)性疾病，術(shù)前均簽訂知情同意書，并經(jīng)武警總醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。實(shí)驗(yàn)于 2010年1月–2012年 1月在本科室完成。

1.1.2 主要試劑和儀器 α-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基、I 型膠原酶和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；小鼠抗人 CD14-PE、CD29-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-FITC 購(gòu)自美國(guó) Biosciences 公司；秋水仙素購(gòu)自上海瑞朗商貿(mào)有限公司；倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)購(gòu)自日本 Olympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 自體脂肪干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng) 患者下腹部抽取 15～20 ml 自體脂肪顆粒，離心 2 次，取脂肪層，加 0.075% I 型膠原酶于 37 ℃ 消化60 min，1500 r/min 離心 15 min，去除上層脂肪組織，沉淀用生理鹽水重懸，70 μm 細(xì)胞篩過濾，去除殘余結(jié)締組織，再次以 1500 r/min 離心 5 min，加入紅細(xì)胞裂解液，裂解 5 min，用生理鹽水清洗2 遍，計(jì)數(shù)，用 α-MEM 培養(yǎng)基以 106個(gè)/ml 鋪于培養(yǎng)皿中。記為 P0 代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，0.05% 胰蛋白酶消化，按照 1∶6 的比例傳代。

1.2.2 自體脂肪干細(xì)胞免疫表型鑒定 取第 3 代自體脂肪干細(xì)胞，胰酶消化，PBS 清洗 2 遍，分別標(biāo)記小鼠抗人 CD14-PE、CD29-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-FITC、CD73-PE、HLA-ABC-FITC、HLA-DR-FITC 單抗，對(duì)照管加入小鼠 IgG 抗體，室溫避光孵育 30 min，PBS 清洗 2 次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 分化潛能鑒定 取第 3 代自體脂肪干細(xì)胞，加入成脂、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，分別用油紅 O 和 ALP 染色試劑盒鑒定。

1.2.4 遺傳穩(wěn)定性鑒定 取第 3 代自體脂肪干細(xì)胞，做常規(guī)涂片，Giemsa 染色，油鏡下觀察，分析鑒定[2-3]。

1.2.5 分組情況 實(shí)驗(yàn)組共 50 例，其中隆胸患者 15 例，面部美容充填患者 35 例。二期吸脂方法同一期，吸脂量為 30～450 ml（根據(jù)充填部位的需要），脂肪注射針頭用外徑 3 mm 的不銹鋼針，在皮下和腺體后間隙注入脂肪顆粒和 3～6 代hADSCs 混合物（1 ml 脂肪微?；旌?5×106個(gè)hADSCs）。對(duì)照組病例 10 例，其中隆胸患者4 例，面部美容充填患者 6 例。對(duì)照組為單純自體脂肪移植組，方法與實(shí)驗(yàn)組二期手術(shù)一致，但不加自體脂肪干細(xì)胞，脂肪填充量同實(shí)驗(yàn)組。隆胸患者兩側(cè)乳房分別注入最小量 150 ml，最大量為 450 ml；面部美容充填最小量為 3 ml，最大量20 ml。注射移植部位輕壓包扎固定，供脂肪部位加壓包扎。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs 細(xì)胞形態(tài)觀察

接種后 24 h，倒置顯微鏡下觀察，大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁，成梭形，同時(shí)混有少量未貼壁的圓形淋巴細(xì)胞（圖 1A）；接種 48 h 后，換液將淋巴細(xì)胞去除，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，細(xì)胞呈現(xiàn)旋渦狀生長(zhǎng)（圖 1B）；細(xì)胞傳至第 3 代，未見形態(tài)上有任何差異（圖 1C）。

2.2 hADSCs 免疫表型

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示：第 3 代 hADSCs 高表達(dá) CD29、CD44、CD73 和 HLA-ABC，陽(yáng)性率均大于 95%；但不表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志物 CD31、CD14，造血細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD34、CD45 以及 II 類主要組織相容性抗原 HLA-DR 的陽(yáng)性率低于 3%（圖 2）。

2.3 hADSCs 多向分化及遺傳穩(wěn)定性

第 3 代 hADSCs 在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo) 8 d后，細(xì)胞變圓，油紅 O 染色后顯示細(xì)胞內(nèi)有大量脂滴生成（圖 3A）；在加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基 3 周后，ALP 染色顯示大量成骨細(xì)胞生成（圖 3B）。顯示第 3 代 hADSCs 具有多向分化潛能。染色體分析報(bào)告顯示：第 3 代 hADSCs 細(xì)胞染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)目均未見異常，呈二倍體結(jié)構(gòu)（圖3C），說明其核型是穩(wěn)定的。

2.4 患者移植后回訪分析與對(duì)照組比較

對(duì)照組采用單純自體脂肪移植患者 10 例，其中3例出現(xiàn)疼痛、上肢活動(dòng)受限及發(fā)熱等不良反應(yīng)，抗生素使用 7 d，感染得到控制，4 名患者經(jīng)過 4 次脂肪移植達(dá)到手術(shù)滿意。滿意率 64.2%。實(shí)驗(yàn)組 50 例患者均無(wú)并發(fā)癥出現(xiàn)，抗生素的預(yù)防使用為 3 d，2 名患者經(jīng)過 2 次以上的脂肪移植，其余患者均為 2次。滿意率 85.7%。圖 4 為隆頦前后的效果對(duì)比圖。圖 5 為隆顴前后的效果對(duì)比圖。圖 6 為隆胸前和隆胸后 12、24 個(gè)月效果對(duì)比圖。外形明顯改變，有較好的美容效果。MRI顯示乳房局部皮下脂肪組織厚度及腺體后脂肪厚度明顯超過其他周圍組織的皮下脂肪組織厚度，而腺體未見任何病變（圖 7）。

圖2 hADSCs 免疫表型Figure2 The immunophenotype of hADSCs

圖3 分化潛能（A：成脂誘導(dǎo) 8 d；B：成骨誘導(dǎo) 3 周；C：P3 代 hADSCs 細(xì)胞染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)目均未見異常）Figure3 Differentiation potential (A: Adipogenic induction after 8 days; B: Osteogenic induction after 3 weeks; C: Chromosome analysis report showed that morphology, structure and the number of the third generation of hADSCs cells chromosome showed no abnormality)

圖4 隆頦前后的效果（A：移植前；B：移植后）Figure4 Chin augmentation effect (A: Before operation; B:After operation)

圖5 隆顴前后的效果（A：移植前；B：移植后）Figure5 Cheekbones augmentation effect (A: Before operation; B: After operation)

圖6 隆胸前后的效果（A：移植前；B：移植后 12 個(gè)月；C：移植后 24 個(gè)月）Figure6 Breast augmentation effect (A: Before operation; B: 12 months after operation; C: 24 months after operation)

3 討論

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，具有組織修復(fù)與重建的功能[3]。自 Zuk等[4]2002年成功從脂肪組織分離出干細(xì)胞并命名為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞得到極大關(guān)注，與骨髓來源的 MSCs 相比，脂肪干細(xì)胞儲(chǔ)量更加豐富，取材更加方便，患者痛苦小，干細(xì)胞擴(kuò)增能力更強(qiáng)，因此脂肪干細(xì)胞是組織工程的理想種子細(xì)胞[5-8]。最近的研究證明，脂肪干細(xì)胞可以向中胚層的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化，也可以向心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肝臟細(xì)胞分化，表明了脂肪干細(xì)胞的多向分化潛能。

圖7 患者術(shù)后 24 個(gè)月乳腺核磁共振檢查顯示患者乳房局部皮下脂肪厚度平均 3.5 cm，胸骨前皮下脂肪組織 1 cm 厚度，腺體組織無(wú)異常Figure7 Breast MRI showed that patients with breast local subcutaneous fat thickness of 3.5 cm on average, anterior chest subcutaneous adipose tissue of 1 cm thickness, gland tissue without exception after 24 months

本研究采用的 hADSCs 介導(dǎo)的自體脂肪移植術(shù)是將具有分化成脂肪細(xì)胞潛能的，且遺傳穩(wěn)定的自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞注射移植進(jìn)行面部塑形和隆胸。研究發(fā)現(xiàn)，其具有提高移植脂肪細(xì)胞的成活率，促進(jìn)移植脂肪的血管再生，減少脂肪顆粒吸收、液化、感染等并發(fā)癥，減少脂肪移植手術(shù)次數(shù)，成形效果好等優(yōu)勢(shì)。分析其原因可能在于：① hADSCs具有分化成脂肪細(xì)胞的能力，注入的 hADSCs單次增加脂肪細(xì)胞的移植數(shù)量約能達(dá) 5×108個(gè)，hADSCs 可以以移植入體內(nèi)的脂肪顆粒細(xì)胞為支架，在其周圍聚積，分化成脂肪細(xì)胞及自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。50 例患者術(shù)后 6 ～24 個(gè)月均無(wú)明顯的外形改變或回縮，外形滿意率為 85.7%。② hADSCs 具有分泌細(xì)胞因子、基質(zhì)的能力，可以促進(jìn)移植脂肪顆粒的血管再生，增強(qiáng)移植的脂肪顆粒細(xì)胞的穩(wěn)定，同時(shí) hADSCs 以脂肪顆粒細(xì)胞為模板進(jìn)行增殖分化。③體外培養(yǎng)擴(kuò)增的脂肪干細(xì)胞單一穩(wěn)定，在移植前脂肪干細(xì)胞再次進(jìn)行免疫表型、遺傳穩(wěn)定、分化潛能的檢測(cè)可以保證移植細(xì)胞的質(zhì)量。④研究證實(shí)每毫升脂肪組織中可得到有核細(xì)胞 1×105～1×107。進(jìn)行移植的hADSCs 數(shù)量取其平均值為 5×106/ml 脂肪顆粒，脂肪顆粒為移植的 hADSCs 起到支架作用，hADSCs 以脂肪顆粒細(xì)胞為模板進(jìn)行增殖分化，可能更符合脂肪組織的生物性狀態(tài)，單純脂肪顆粒移植沒有 hADSCs 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境，出現(xiàn)移植脂肪細(xì)胞的成活率低，脂肪顆粒吸收、液化、感染等并發(fā)癥是毋庸置疑的。

隆胸患者隨訪兩年的 MRI 顯示，hADSCs 介導(dǎo)的自體脂肪移植并沒有增加腺體的體積，只是增加了乳房局部皮下脂肪組織的厚度，是對(duì)女性乳腺組織安全的隆胸手術(shù)。研究顯示，hADSCs 介導(dǎo)的自體脂肪移植術(shù)具有微創(chuàng)、移植脂肪成活率高、成形效果好等優(yōu)點(diǎn)，是具有發(fā)展前途的、值得推薦的再生醫(yī)學(xué)技術(shù)。

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