劉 佳，王鴻雁，鄧 元，曹培龍，李曉鋒

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，陜西西安 710061)

乳腺癌是一種分子水平高度異質(zhì)性的腫瘤，即使是同種組織學(xué)類型、同種臨床分期的乳腺癌患者，他們的預(yù)后及治療敏感性也不完全相同，因此，人們逐步將目光轉(zhuǎn)向分子診斷技術(shù)。2000年，Perou等［1］采用 cDNA 微芯片技術(shù)，根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)的表達(dá)差異，將乳腺癌分為腔型(luminal subtype)、HER-2(+)型(HER-2-over-expression subtype)、基底細(xì)胞樣型(basallike subtype，BLs)及正常乳腺樣型(normal breast-like subtype，NBLs)。乳腺癌各分子亞型具有不同的臨床病理特征，并與不同的臨床結(jié)局相關(guān)，Basal-Like型由于缺乏特異性預(yù)后標(biāo)記物近年來成為人們研究的焦點。

EZH2(enhancer of zeste homolog2，EZH2)是1996年發(fā)現(xiàn)的一種新基因，研究發(fā)現(xiàn)EZH2可明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因而促進細(xì)胞增殖擴散，促進細(xì)胞周期演進和惡性變，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系［2-3］。

作者在研究乳腺癌各分子亞型不同預(yù)后的基礎(chǔ)上，采用免疫組化方法檢測EZH2的表達(dá)，探討EZH2與乳腺癌分子亞型及臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為EZH2成為乳腺癌分子亞型特異性標(biāo)記物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床材料 收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2000年1月-2005年12月間改良根治切除的浸潤性乳腺癌80例，所有病例具有完整的臨床資料并具備ER、PR、HER-2結(jié)果(除去HER-2不確定病例)，患者電話隨訪截至2011年1月，隨訪時間61～132個月，平均67.46個月。80例患者均為女性，年齡30～80歲，中位年齡50歲;絕經(jīng)前43例，絕經(jīng)后37例;26例患者有同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;非特異性浸潤性導(dǎo)管癌58例，浸潤性小葉癌9例，髓樣癌7例，粘液癌6例;58例非特異性浸潤性導(dǎo)管癌Ⅰ級3例，Ⅱ級19例，Ⅲ級36例。術(shù)后臨床Ⅰ期28例，Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期14例?；颊咝g(shù)前均未接受放化療。11例患者因為乳腺癌或治療相關(guān)因素死亡。

1.1.2 抗體和試劑 兔抗人ER單克隆抗體(RMA-0501)，兔抗人 PR單克隆抗體(RMA-0502)，兔抗人 HER-2單克隆抗體(RMA-0555)，均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司;鼠抗人CK5/6單克隆抗體(ZM-0313)，鼠抗人CK14單克隆抗體(ZM-0311)，兔抗人EGFR單克隆抗體(ZA-0505)，兔抗人EZH2多克隆抗體(ZA-0133)，PV-6000-G通用型二步法檢測試劑盒18ml，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二甲苯，梯度乙醇，甲醇30%H2O2溶液均為天津科密歐試劑有限公司產(chǎn)品;DAB(3，3-二氨基聯(lián)苯胺)購自福州邁新生物公司;二甲基亞砜購自天津化學(xué)試劑一廠。

1.1.3 儀器和器材 RM2315旋轉(zhuǎn)式組織切片機(德國Leica公司)，YT-7F生物組織攤烤片機(中國湖北)，蘇泊爾電磁爐，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，Eppendorf 5418小型高速離心機(德國Eppendorf公司)，BX40顯微鏡成像系統(tǒng)(日本 OLYMPUS 公司)，微量進樣器(1μL、5μL，上海安寧微量進樣器廠);Eppendorf離心管，玻璃燒杯，量筒，濾紙片，切片孵育濕盒，封口膜，吸管，蓋玻片，中性樹膠。

1.2 免疫組化Max Vision快捷方法 蠟塊切片，切片厚度2～4 μm，置入60℃恒溫孵育箱過夜;切片經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇逐步水化后，3%甲醇雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min;蒸餾水洗3次，3 min/次;PBS緩沖液沖洗3次，3 min/次;各免疫指標(biāo)按照抗體說明書，選用抗原修復(fù)方法(CK14及EZH2用檸檬酸抗原熱修復(fù)、CK5/6采取EDTA抗原熱修復(fù)、EGFR采用胰酶消化);PBS沖洗切片3次，3 min/次;滴加一抗80μL/張，30℃孵育3 h;PBS緩沖液沖洗切片3次，3 min/次;滴加二抗80μL/張，室溫下或37℃孵育30 min;PBS洗切片3次，3 min/次;DAB顯色1～2 min，顯微鏡下控制顯色效果，自來水沖洗;蘇木素復(fù)染2～5 min，自來水沖洗;梯度乙醇脫水、二甲苯透明后樹膠封片。用已知陽性組織作陽性對照片，同型陰性對照作陰性對照片。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 免疫組化陽性結(jié)果定位 ER、PR、EZH2陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核呈棕黃色著色;HER-2陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，細(xì)胞膜呈黃色或棕黃色著色;CK5/6、CK14陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色著色;EGFR陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈棕黃色著色。

1.3.2 陽性判讀標(biāo)準(zhǔn) (1)ER、PR染色強度:0分為陰性，1分為弱陽性，2分為中等陽性，3分為強陽性;陽性細(xì)胞百分比計分:＜1%計為1分，1% ～10%為2分，11% ～33%為3分，34% ～66%計為4分，≥67%計為5分。染色強度和陽性細(xì)胞百分比所計分?jǐn)?shù)兩項相加≥3者為 ER/PR陽性［4］。(2)陽性細(xì)胞數(shù) ＞10%視為 CK5/6、CK14、EGFR 陽性［5］。(3)陽性細(xì)胞數(shù)＞30%視為EZH2陽性表達(dá)［6］。(4)按照乳腺癌 HER-2 檢測指南(2009 版)［7］，HER-2(3+)為陽性表達(dá):＞30%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強、完整的細(xì)胞膜棕褐著色;不確定表達(dá):即HER-2(2+)，為至少10%的腫瘤細(xì)胞有完整的細(xì)胞膜著色，著色不均勻或強度弱;HER-2(-)或HER-2(1+)為HER-2陰性:癌細(xì)胞不著色或任何比例的浸潤性癌細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細(xì)胞膜著色。

1.4 乳腺癌分子亞型劃分方法 Luminal型乳腺癌:ER(+)/PR(+)、HER-2(-);HER-2(+)型乳腺癌:ER(-)、PR(-)、HER-2(3+);Basal-like型乳腺癌:ER(-)、PR(-)、HER-2(-)、CK5/6(+)/CK14(+)/EGFR(+);Normal breast-like型乳腺癌:ER(-)、PR(-)、HER-2(-)、CK5/6(-)、CK14(-)、EGFR(-)［8-9］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 結(jié)果采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。組間比較采用χ2檢驗和非參數(shù)秩和檢驗;生存分析采用 Kaplan-Meier法，生存曲線間用Log-rank檢驗比較;P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 圖1所示為ER、PR、HER-2、CK5/6、CK14、EGFR、EZH2 陽性表達(dá)圖，陽性表達(dá)率分別為 48.74%(39/80)、55.00%(44/80)、18.75%(15/80)、15.00%(12/80)、11.25%(9/80)、72.50%(58/80)、45.00%(36/80)。

2.2 分子亞型的構(gòu)成 在80例乳腺癌研究對象中，Luminal型、HER-2(+)型、Basal-like型和Normal breast-like型乳腺癌分別占61.25%(49 例)、10.00%(8 例)、25.00%(20 例)、3.75%(3例)。由于Normal breast-like型乳腺癌例數(shù)過少，因此暫不予統(tǒng)計。

2.3 分子亞型與臨床病理特征的關(guān)系 數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得到，乳腺癌分子亞型與患者的年齡、腫瘤大小、同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型、組織學(xué)分級、術(shù)后臨床分期均無相關(guān)性(P ＞0.05)，與絕經(jīng)與否有關(guān)(P=0.036 ＜0.05)。77例乳腺癌患者，10例死于乳腺癌或者治療相關(guān)因素，病死率為12.99%，死亡病例分別為 Luminal型3例、HER-2(+)型1例、Basal-like型乳腺癌6例，各分子亞型組病死率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.168，P=0.028 ＜0.05)。

2.4 乳腺癌分子亞型預(yù)后分析 在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，進一步進行Kaplan-Meier生存分析顯示:Luminal型、HER-2(+)型、Basal-like型乳腺癌患者平均生存時間(月)分別為119、89、69，三組分子亞型總生存率差異整體水平間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank=7.175，P=0.028 ＜0.05);經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn) Luminal型與Basal-like型乳腺癌患者總生存率間差異有統(tǒng)計學(xué) 意 義 (Log-rank=7.324，P=0.007 ＜0.016)，HER-2(+)型與 Basal-like型乳腺癌患者總生存率間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rank=0.668，P=0.414 ＞0.016)(圖 2)。

2.5 EZH2與臨床病理特征的關(guān)系 由表1中數(shù)據(jù)可見，EZH2陽性表達(dá)與患者的年齡、絕經(jīng)與否、腫瘤大小、腫瘤的組織學(xué)類型均不相關(guān)(P＞0.05)，與同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、腫瘤組織學(xué)分級和術(shù)后臨床分期相關(guān)(P＜0.05)。同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組共25例，其中EZH2陽性表達(dá)22例(陽性表達(dá)率88.00%)高于同側(cè)腋窩淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組(P=0.001);截至隨訪終止時間，共有10例患者死亡，其中7例EZH2陽性表達(dá)，EZH2陽性表達(dá)組病死率20.00%(7/35)，患者中位生存時間為47個月;3例患者EZH2陰性，EZH2陰性組病死率7.14%(3/42)，患者中位生存時間為49個月;兩組病死率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.095 ＞0.05)。

圖2 77例浸潤性乳腺癌患者各分子亞型的總生存率Fig.2 Overall survival rates of molecular subtypes in 77 cases with invasive breast cancers

表1 EZH2與臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 Relationship between EZH2 and clinicpathologic parameters (%，n=77)

2.6 EZH2與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析顯示:EZH2的表達(dá)狀態(tài)與乳腺癌患者總生存率無相關(guān)性(Log-rank=2.788，P=0.095)。

2.7 EZH2在乳腺癌分子亞型中的表達(dá) 77例乳腺癌研究病例中，EZH2陽性表達(dá)率為45.45%(35/77)。Luminal型組 EZH2陽性表達(dá) 率 為 34.60%(17/49)，HER-2(+)型50.00%(4/8);Basal-like 型 70.00%(14/20)，高于EZH2在Luminal型和HER-2(+)型兩組中的陽性表達(dá)率。三組乳腺癌EZH2陽性表達(dá)率的差異經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.215，P=0.027 ＜0.05)。見表2。

表2 EZH2在乳腺癌分子亞型中的表達(dá)Table 2 The expressions of EZH2 in molecular subtypes of breast carcinoma (%，n=77)

表2數(shù)據(jù)可見，EZH2在HER-2(+)型、Basal-like型乳腺癌中陽性表達(dá)率高于Luminal型乳腺癌，前兩者乳腺癌均為ER和PR陰性的乳腺癌，我們經(jīng)Spearman雙變量相關(guān)性分析得到:EZH2與ER、PR之間均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.260，P=0.020 ＜ 0.05;r=-0.242，P=0.030 ＜0.05)。

3 討論

自乳腺癌分子亞型的概念提出后，人們采用免疫組織化學(xué)方法展開對各分子亞型乳腺癌臨床病理特征和治療反應(yīng)性的研究。國內(nèi)外已有相關(guān)研究報道，然而結(jié)果并不完全統(tǒng)一。

Wiechmann 等［8］報道:Luminal型乳腺癌在分子亞型中所占比例最高且預(yù)后較好;HER-2(+)型占6%，預(yù)后不良;Basal-like型乳腺癌約占15%，總生存率最低。與Luminal型乳腺癌相比，HER-2(+)型乳腺癌更容易表現(xiàn)出同側(cè)腋窩淋巴結(jié)受累、血管淋巴管侵犯、局部復(fù)發(fā)率高的特點;各亞型與患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)受累、血管淋巴管侵犯、細(xì)胞核分級等參數(shù)均具有相關(guān)性。而另一則報道顯示，HER-2(+)型乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險 39.4%、病死率33.3%，均高于其他類型乳腺癌，因此 HER-2(+)乳腺癌預(yù)后最差［10］;三種分子亞型組織學(xué)分級的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗發(fā)現(xiàn)，Basal-like型乳腺癌患者病死率30%，預(yù)后最差，這與Wiechmann等的報道是一致的;但乳腺癌分子亞型和患者絕經(jīng)與否外的其他臨床病理參數(shù)均無相關(guān)性，這與上述文獻(xiàn)不符，我們考慮這與實驗方法和環(huán)境、免疫組化判讀標(biāo)準(zhǔn)不同、研究對象種族差異等因素有關(guān)。盡管乳腺癌分子亞型對患者預(yù)后判斷的優(yōu)勢得到證實，但腫瘤形態(tài)學(xué)仍然適應(yīng)于臨床治療和預(yù)后風(fēng)險預(yù)測的需要，此實驗還嘗試將乳腺癌分子亞型與傳統(tǒng)病理組織學(xué)形態(tài)相結(jié)合，以期發(fā)現(xiàn)兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系。實驗結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織學(xué)類型與分子亞型的相關(guān)性。Sek等［11］選用乳腺Paget's病患者為研究對象進行分子亞型的分析，得出HER-2(+)型是乳腺Paget's病的優(yōu)勢亞型，占86%(37/43)，Luminal A型、Luminal B型分別占2%和12%，沒有表現(xiàn)為Basal-like型的患者。這又對分子亞型的組織學(xué)構(gòu)成做了補充。

EZH2是一種基因抑制復(fù)合物，屬于PcG多梳基因家族，主要通過減少轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，抑制靶基因在染色體結(jié)構(gòu)中的表達(dá)，EZH2不僅通過使腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因功能失活，亦可通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用［12］。目前已知EZH2在前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均有高水平表達(dá)。Raaphorst［13］等用正常乳腺組織、癌前病變組織、浸潤性乳腺癌研究EZH2在三者中的表達(dá)，結(jié)果顯示正常乳腺組織不表達(dá)EZH2，而在乳腺癌特別是低分化乳腺癌中表達(dá)水平明顯高于癌前病變組織。同樣的，Wang［6］等用結(jié)腸癌及癌旁組織研究得到EZH2陽性表達(dá)率在不同臨床分期差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，EZH2為結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后指標(biāo)。Reijm等［14］對EZH2陽性表達(dá)乳腺癌采用三苯氧胺治療后，其臨床緩解率低于EZH2陰性者，患者生存期短，因此三苯氧胺治療的乳腺癌患者若EZH2陽性表達(dá)常預(yù)示預(yù)后不良。然而，患者在臨床治療中，往往內(nèi)分泌治療的同時采用聯(lián)合化療的方法，因此，驗證該實驗結(jié)果尚存在困難。

EZH2與乳腺癌分子亞型關(guān)系的研究報道尚少，Gonzalez等［15］在研究 EZH2 與 BRCA1 的關(guān)系時報道，EZH2在ER陰性乳腺癌中顯著高表達(dá)，強調(diào)了EZH2對于該型乳腺癌生長和預(yù)后的重要意義。同時又有文獻(xiàn)進一步報道，EZH2是ER陰性乳腺癌的較特異性標(biāo)記物之一［16］。因此，EZH2有望成為基底細(xì)胞樣型乳腺癌診斷或預(yù)后的因子。

本課題乳腺癌中EZH2陽性表達(dá)率在同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、術(shù)后臨床分期中的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，與患者年齡、絕經(jīng)與否、腫瘤大小和組織學(xué)類型無關(guān)(P＞0.05);EZH2在同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級和術(shù)后臨床分期高的患者中陽性表達(dá)率，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級及臨床分期低者。但是，EZH2陽性表達(dá)組和陰性組患者的死亡率和總生存率之間的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示EZH2的表達(dá)狀態(tài)尚不是影響乳腺癌患者總生存率的因素。我們對EZH2與乳腺癌分子亞型關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)，EZH2在 Luminal型、HER-2(+)型、Basal-like型乳腺癌中陽性表達(dá)率分別為 35.00%、50.00%、70.00%，各分子亞型之間 EZH2 陽性表達(dá)率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.027＜0.05)，這表明 Basal-like型乳腺癌 EZH2的陽性表達(dá)率高于其他兩組，提示EZH2或許可作為Basal-like型乳腺癌的標(biāo)記物之一。EZH2與 ER、PR 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.260，P=0.020;r=-0.242，P=0.030)，ER、PR 陽性表達(dá)水平越高，EZH2陽性表達(dá)率反而越低。這與Reijm［14］等所得 EZH2與ER關(guān)系的結(jié)論(r=-0.330，P ＜0.001)是一致的，提示 EZH2 可作為激素受體陰性乳腺癌特別是Basal-like型乳腺癌的分子標(biāo)記物之一。由于Basal-like型乳腺癌同免疫組化建立的三陰性乳腺癌具有相似的免疫表型和臨床特征，ER、PR陰性同時絕大部分伴有BRCA1缺失或突變，EZH2通過調(diào)節(jié)BRCA1蛋白表達(dá)和BRCA1磷酸化水平促進細(xì)胞增殖并使細(xì)胞向G2/M期轉(zhuǎn)化，當(dāng)BRCA1水平下降時，它逆向上調(diào) EZH2［14-15］，因此 Basallike型乳腺癌常有EZH2高表達(dá)，預(yù)后很差。這為EZH2陽性表達(dá)患者預(yù)后不良和EZH2成為Basal-like型乳腺癌特異性標(biāo)記物的觀點提供了理論支持。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)EZH2陽性表達(dá)多存在于組織學(xué)分級高、臨床分期晚及同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，因此EZH2陽性表達(dá)患者往往預(yù)后不良。盡管EZH2不同表達(dá)狀態(tài)時患者總生存率的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但具有不同預(yù)后的各分子亞型間EZH2的陽性表達(dá)率卻有顯著趨勢，即EZH2在預(yù)后較差的Basal-like型乳腺癌中高表達(dá)，并且EZH2與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、術(shù)后臨床分期等預(yù)后相關(guān)指標(biāo)存在密切正相關(guān)關(guān)系，因此，我們認(rèn)為EZH2具有評價乳腺癌患者預(yù)后的價值。適當(dāng)增加樣本量，或許可以得到預(yù)期結(jié)果。乳腺癌的預(yù)后不是單一因素作用的結(jié)果，將分子亞型與傳統(tǒng)的臨床病理參數(shù)相結(jié)合，綜合評價才能獲得更好的效果。

［1］PEROU，CHARLES M，SERLIE，et al.Molecular Portraits of human breast tumors ［J］.Nature，2000，406:747-747.

［2］VARAMBALLY S，DHANSEKARAN S M，ZHOU M，et al.The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer［J］.Nature，2002，419(6907):624-629.

［3］SATIJN D P，OTTE A P.Polycomb group protein complexes:do different complexes regulate distinct target genes［J］?Biochim Biophys Acta，1999，1447:1.

［4］HARVEY J M，CLARK G M，OSBORNE C K，et al.Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to adjuvant endocrine therapy in breast cancer［J］.J Clin Oncol，1999，17(5):1474-1481.

［5］DELGALLO W D，RODRIGUES JRP，BUENO S P，et al.Cell blocks allow reliable evaluation of expression of basal(ck5/6)and luminal(ck8/18)cytokeratins and smooth muscle actin(SMA)in breast carcinoma ［J］.Cytopathology，2010，21:259-266.

［6］WANG C G，YE Y J，YUAN JING，et al.EZH2 and STAT6 expression profiles are correlated with colorectal cancer stage and prognosis［J］.World J Gastroenterol，2010，16(19):2421-2427.

［7］The Writing Group of guidelines for HER2 detection in breast cancer，the 2009 version(乳腺癌 HER2檢測指南:2009版編寫組).Guidelines for HER2 detection in breast cancer，the 2009 version ［J］.CHINESE JOURNAL OF PATHOLOGY(中華病理學(xué)雜志)，2009，38(12):836-840.

［8］WIECHMANN L，SAMPSON M，STEMPEL M，et al.Presenting features of breast cancer differ by molecular subtype ［J］.Ann Surg Oncol，2009(16):2705-2710.

［9］KIM M J，RO J Y，AHN S H.Clinicopathologic significance of the basal-like subtype of breast cancer:a comparison with hormone receptor and Her2/neu-overexpressing phenotypes［J］.Human Pathology，2006，37:1217-1226.

［10］MUNOZ M，ACENERO J F，MARTIN S，et al.Prognostic significance of molecular classification of breast invasive ductal carcinoma ［J］.Arch Gynecol Obstet，2009，280:43-48.

［11］SEK P，ZAWROCKI A，BIERNAT W，et al.HER-2 molecular subtype is a dominant subtype of mammary Paget，s cells.An immunohistochemical study［J］.Histopathology，2010，57:564-571.

［12］WAGERBER N，HOLLAND D，BULKESCHER J，et al.The enhancer of zeste homolog 2 gene contributes to cell proloferation and apoptosis resistance in renal cell carcinoma cells［J］.Int J Cancer，2008，123:1545-1550.

［13］RAAPHORST F M，MEIJER C J，F(xiàn)IERET E，et al.Poorly differentiated breast carcinoma is associated with increased expression of the human polycomb group EZH2 gene ［J］.Neoplasia，2003，5(6):481-488.

［14］REIJM E A，JANSEN M，RITSTIER K R.Decreased expression of EZH2 is associated with upregulation of ER and favorable outcome to tamoxifen in adnanced breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，125:387-394.

［15］GONZALEZ M E，LI X，TOY K，et al.Downregulation of EZH2 decreases growth of estrogen receptor-negative invasive breast carcinoma and requires BRCA1 ［J］.Oncogene，2009，28:843-853.

［16］CELINA G，KLEER M D.Carcinoma of the breast with medullary-like features diagnostic challenges and relationship with BRCA1 and EZH2 functions［J］.Arch Pathol Lab Med，2009，133:1822-1825.