高 潔，汪 蕊，楊清玲，陳昌杰，吳 窮

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.腫瘤內(nèi)科，3.蚌埠醫(yī)學(xué)院生化教研室，安徽蚌埠 233000)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，HCC在我國(guó)年發(fā)病約34.7萬(wàn)人，死亡約32.3萬(wàn)人，在城市居民中的死亡率僅次于肺癌，居癌癥死亡率的第二位，而在農(nóng)村居民中的死亡率則居各種癌癥之首，所以HCC在我國(guó)被稱(chēng)為“癌中之王”［1］。尋求高效低毒的抗腫瘤藥物及治療方法一直是HCC治療研究的熱點(diǎn)。

1996年第三代鉑類(lèi)化合物奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)作為治療結(jié)直腸癌的二線治療藥物在法國(guó)上市，化學(xué)名為左旋反式二氨環(huán)己烷草酸鉑，國(guó)際通用名為草酸鉑。其藥理學(xué)特性與其他鉑類(lèi)藥物相似，也以DNA作為靶作用部位，鉑原子與DNA鏈形成鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)，從而阻斷其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［2］。近年來(lái)國(guó)外的研究表明，L-OHP可聯(lián)合其他藥物對(duì)晚期HCC顯示出較好的抗腫瘤活性［3，4］。國(guó)內(nèi)初步臨床研究也表明，以L-OHP為主的化療方案對(duì)于我國(guó)HCC的療效較好，且安全性高，不良反應(yīng)較輕，耐受性好。但L-OHP抗肝癌作用的實(shí)驗(yàn)研究開(kāi)展得比較遲，甚至晚于臨床試驗(yàn)。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于L-OHP對(duì)肝癌細(xì)胞的周期調(diào)控機(jī)制研究還不深入。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用先進(jìn)的研究方法觀察L-OHP作用肝癌細(xì)胞后，所引起的細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)因子的變化，對(duì)于揭示LOHP治療HCC的作用機(jī)理具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，用PBS漂洗細(xì)胞后換0.1%的胰酶消化細(xì)胞，再用完全培養(yǎng)液從瓶壁上洗脫細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司);胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);HEPES(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);L-OHP(美國(guó)Sigma公司，純度 ＞99.9%，用蒸餾水溶解，配成 10 μg/ml貯存液，過(guò)濾后分裝，-4℃?zhèn)溆?;CDK2、CDK4多克隆抗體(兔抗人，武漢博士德)，CyclinD1、p16、p21、p53單克隆抗體(鼠抗人，Santa Cruze公司);噻唑藍(lán)［(MTT，美國(guó)Sigma公司)，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)配制成 5 mg/ml的溶液，-20℃避光保存］。

1.3 細(xì)胞增殖的測(cè)定(MTT法) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制成5×103個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，充分吹打后接種于96孔板中，200μL/孔。設(shè)空白對(duì)照組(培養(yǎng)基200μL)，對(duì)照組(單細(xì)胞懸液200μL)，實(shí)驗(yàn)組。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的L-OHP，其終濃度分別為 0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/ml，每個(gè)濃度設(shè) 6 個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72h，吸去培養(yǎng)液，換上無(wú)血清的DMEM，并加入 MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后徹底棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入150μL DMSO，混勻10 min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔490 nm處的吸光度A值。按下列公式計(jì)算:細(xì)胞增殖抑制率 =1-(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的改變 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HepG2細(xì)胞，按5×103個(gè)/ml的濃度，2 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組不加藥物，實(shí)驗(yàn)組加入L-OHP(1 μg/ml)使其終濃度分別為 4、32 μg/ml，作用 24、48 h后收集細(xì)胞。方法如下:1 000 r/min×5 min，冷PBS洗滌后迅速用預(yù)冷的70%乙醇固定，-20℃過(guò)夜后，離心除去乙醇，冷PBS洗滌，PI染色，避光孵育染色20 min后FCM檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相的分布。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按5×103個(gè)/ml的濃度，2 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組不加藥物，實(shí)驗(yàn)組加入L-OHP(1 μg/ml)使其終濃度分別為 4、32 μg/ml，作用24、48 h后收集細(xì)胞。加Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(引物序列詳見(jiàn)表1)。PCR 反應(yīng)體系為25μL(上游引物1μL，下游引物 1μL，cDNA 1μL，2 × Easy Taq PCR Super Mix 12.5μL，ddH2O 9.5μL)，條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性 30 s，退火溫度 30 s，72℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。目的基因與內(nèi)參異管擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度Table 1 Primer sequence and amplification length

1.6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，按5×103個(gè)/ml的濃度，2 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組不加藥物，實(shí)驗(yàn)組加入LOHP(1 μg/ml)使其終濃度分別為 4、32 μg/ml，作用24、48 h后收集細(xì)胞。提取細(xì)胞核蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，95℃變性5 min，上樣40 μg蛋白，在10%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育2 h，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)目的條帶的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制 對(duì)照組細(xì)胞體外生長(zhǎng)良好，不同濃度L-OHP處理不同時(shí)間后細(xì)胞增殖抑制率不同程度增加，并呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。作用時(shí)間相同時(shí)，隨藥物濃度的增加，增殖抑制率逐漸增加，在較低藥物濃度下，L-OHP對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用表現(xiàn)為一定時(shí)間依賴(lài)性;而在較高藥物濃度下，L-OHP對(duì)細(xì)胞的增殖抑制沒(méi)有明顯時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。

表2 不同濃度L-OHP作用不同時(shí)間后HepG2細(xì)胞抑制率Table 2 Inhibition of HepG2 cell proliferation at different time points after treated different concentrations of L-OHP(%，n=18，)

表2 不同濃度L-OHP作用不同時(shí)間后HepG2細(xì)胞抑制率Table 2 Inhibition of HepG2 cell proliferation at different time points after treated different concentrations of L-OHP(%，n=18，)

與0 μg/ml比較，*:p＜0.05;＊＊:p＜0.01.

劑量(μg/ml)抑制率24 h 48 h 72 h 0 0 0 0 0.5 1.81 ±1.37* 13.31 ±2.05＊＊ 31.04 ±2.77＊＊1.0 9.48 ±1.69＊＊ 23.27 ±3.13＊＊ 35.44 ±1.77＊＊2.0 23.10 ±3.57＊＊ 32.80 ±4.16＊＊ 45.22 ±2.89＊＊4.0 29.80 ±4.14＊＊ 40.29 ±2.69＊＊ 53.27 ±5.64＊＊8.0 33.48 ±2.22＊＊ 50.81 ±4.58＊＊ 65.73 ±4.29＊＊16.0 44.77 ±5.71＊＊ 57.11 ±4.86＊＊ 71.64 ±5.81＊＊32.0 50.79 ±3.46＊＊ 65.52 ±6.13＊＊ 76.32 ±6.41＊＊64.0 56.43 ±5.01＊＊ 73.37 ±3.77＊＊ 84.79 ±3.79＊＊128.0 89.78 ±4.93＊＊ 92.87 ±2.83＊＊ 98.94 ±1.01＊＊

2.2 L-OHP對(duì)HepG2細(xì)胞的周期影響 細(xì)胞周期分布如圖1所示，分別取4、32 μg/ml LOHP作用24、48 h后，與不加藥的空白對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞S期比例明顯增加，而其它兩期細(xì)胞比例相應(yīng)減少。提示L-OHP作用于HepG2細(xì)胞可以導(dǎo)致其S期阻滯，且具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4 μg/ml、32 μg/ml L-OHP作用HepG2細(xì)胞24 h、48 h后細(xì)胞周期分布Fig.1 The cell cycle of HepG2 treated with 4 μg/ml，32 μg/ml concentrations of L-OHP for 24 h，48 h by FCM

2.3 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的變化 如圖3所示，HepG2細(xì)胞隨 LOHP作用時(shí)間延長(zhǎng)和濃度的增加，CDK4、CyclinD1mRNA的表達(dá)逐漸減少，p53、p21mRNA的表達(dá)逐漸上升，CDK2和p16mRNA的表達(dá)則無(wú)明顯變化。

圖2 RT-PCR 檢測(cè) 4、32 μg/mL L-OHP作用HepG2細(xì)胞24、48 h后細(xì)胞周期因子 CyclinD1、CDK2、CDK4、p16、p21、p53在 mRNA水平的表達(dá)Fig.2 The mRNA expression levels of CyclinD1，CDK2，CDK4，p16，p21 and p53 in HepG2 cells treated with 4，32 μg/ml L-OHP for 24，48 h by RT-PCR

2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證(圖 3)，LOHP作用HepG2細(xì)胞不同時(shí)間和濃度后，降低CDK4、CyclinD1的表達(dá)，增加 p21、p53的表達(dá)，而CDK2和p16則沒(méi)有明顯變化?？梢?jiàn)，在LOHP作用過(guò)程中，靶基因在蛋白水平的變化與mRNA水平變化相一致，進(jìn)一步明確了L-OHP的作用環(huán)節(jié)。

圖3 Western blot檢測(cè) 4、32 μg/ml L-OHP作用HepG2細(xì)胞24 h、48 h后細(xì)胞周期因子 CyclinD1、CDK2、CDK4、p16、p21、p53在蛋白水平的表達(dá)Fig.3 The protein expression levels of CyclinD1，CDK2，CDK4，p16，p21 and p53 on HepG2 cells treated with 4，32 μg/ml L-OHP for 24，48 h by Western blot

3 討論

細(xì)胞周期是一個(gè)母細(xì)胞分裂結(jié)束后形成的細(xì)胞至這個(gè)細(xì)胞下一次再分裂結(jié)束形成兩個(gè)子細(xì)胞的這段時(shí)期，是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到L-OHP能夠抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，推測(cè)L-OHP能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期阻滯，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。我們使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)L-OHP干預(yù)后肝癌細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示，L-OHP作用后，使HepG2細(xì)胞S期比例增高，有研究表明細(xì)胞停滯于S期可抑制細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，許多化療藥物也是將腫瘤細(xì)胞阻滯于S期而達(dá)到抗腫瘤療效的［5］。L-OHP作用后引起S期阻滯與我們前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)另一株肝癌細(xì)胞的研究是一致的［6］。

在CyclinD的亞型中，CyclinD1的研究最多，在正常細(xì)胞周期中，CyclinD1與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物使pRb蛋白磷酸化，調(diào)控細(xì)胞從 G1期進(jìn)入 S期，從而完成細(xì)胞增殖［7］。已有研究表明 CyclinD1基因擴(kuò)增和過(guò)度表達(dá)促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，引起細(xì)胞生長(zhǎng)失控，細(xì)胞分裂增殖加速，導(dǎo)致癌變，且與HCC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)顯示L-OHP對(duì)CyclinD1和CDK4有一定的抑制作用，并呈時(shí)間劑量依賴(lài)性，但對(duì)CDK2表達(dá)沒(méi)有影響。L-OHP的抗腫瘤機(jī)制可能與CyclinD1的生成減少和CyclinD1-CDK4復(fù)合體活性降低有關(guān)，使細(xì)胞阻滯于S期，抑制細(xì)胞增殖。

為了進(jìn)一步證明L-OHP抗肝癌細(xì)胞機(jī)制，測(cè)定了CDK4蛋白。CDK4的功能是作為G1期正調(diào)控因子，其活化后導(dǎo)致pRb磷酸化，釋放出核轉(zhuǎn)錄因子E2F，促使細(xì)胞DNA復(fù)制，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程［9］。研究發(fā)現(xiàn)CDK4在一些癌癥病例中，在初期的腫瘤和轉(zhuǎn)移的腫瘤里邊都發(fā)現(xiàn)了CyclinD1-CDK4復(fù)合物的過(guò)表達(dá)［10］。在原發(fā)性肝癌中，CDK4較高的表達(dá)水平具有普遍性。在本研究中，L-OHP降低肝癌細(xì)胞株HepG2CDK4的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L-OHP通過(guò)降低CDK4表達(dá)水平，抑制細(xì)胞周期進(jìn)行的正調(diào)控作用。除參與調(diào)控的因子包含起正調(diào)控作用的Cyclin和CDK基因產(chǎn)物，還有起負(fù)調(diào)控作用的CDK抑制因子(CKIs)對(duì)細(xì)胞周期的啟動(dòng)與進(jìn)程受到嚴(yán)格調(diào)控。

p21是抑癌基因，均與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶結(jié)合使后者失活，對(duì)細(xì)胞周期起反向調(diào)節(jié)作用。p21基因是p53基因的下游基因，在功能上繼承了p53基因的抑癌作用，還有研究證實(shí)［11］，p21不同程度地參與調(diào)控了紫外線照射后DNA的損傷修復(fù)及復(fù)制，可從復(fù)制轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步認(rèn)識(shí)p2l對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，p21同時(shí)也是腫瘤預(yù)防和治療一個(gè)靶點(diǎn)［12］。在p21的啟動(dòng)子上游有p53調(diào)控結(jié)合部位，p53可以調(diào)控p21的表達(dá)［13］。但研究發(fā)現(xiàn)，僅野生型的p53蛋白才有激活p21基因的功能，在p53基因發(fā)生突變的樣本中，p21基因的表達(dá)量很低或者不表達(dá)，可造成異常細(xì)胞增生，有益于腫瘤的形成。在腫瘤中約有50%發(fā)生p53基因的突變，這些突變與p21基因的關(guān)系將成為新的研究熱點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，L-OHP作用野生型HepG2后，p53的變化與 p21是一致的，表達(dá)都有所增加。

L-OHP干預(yù)后 p16表達(dá)并無(wú)明顯改變?？赡苁怯啥喾矫嬖蛟斐傻?L-OHP對(duì)某些基因表達(dá)本來(lái)無(wú)調(diào)節(jié)作用，所以觀察不到改變;L-OHP不能夠改變某些基因的表達(dá)總量，但是可以改變其磷酸化水平，從而影響其生物學(xué)活性。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不表明L-OHP對(duì)p16、CDK2無(wú)調(diào)節(jié)作用，須在以后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步檢測(cè)其的磷酸化水平改變情況。

［1］CHINESE SOCIETY OF LIVER CANCER，CHINESE SOCIETY OF CLINICAL ONCOLOGY，CHINESE SOCIETY OF HEPATOLOGY(中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)臨床腫瘤學(xué)協(xié)作委員會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝癌學(xué)會(huì)肝病分會(huì)肝癌學(xué)組).Experts consensus of standard diagnosis and treatment in primary liver cancer［J］.Chinese Clinical Oncology(臨床腫瘤學(xué)雜志)，2009，14(3):259-263.(in Chinese)

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