鄔春曉，沈紅強，夏大靜

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗科，浙江杭州 310006;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院實驗檢驗中心，浙江杭州 310003;3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所，浙江杭州 310058)

Mcl-1是Bcl-2家族多結(jié)構(gòu)域抗凋亡蛋白，Mcl-1的過表達可以促進惡性腫瘤細胞的生存，Mcl-1的表達升高常見于急性髓細胞白血病(AML)，在細胞的生長和分化過程中發(fā)揮重要作用［1-3］。Mcl-1的半衰期較短，在細胞凋亡過程中受細胞內(nèi)信號途徑調(diào)控迅速下調(diào)。Mcl-1蛋白表達下調(diào)可促進腫瘤細胞的凋亡［4-5］。

三尖杉酯堿(HT)、高三尖杉酯堿(HHT)、異三尖杉酯堿(IHT)、脫氧三尖杉酯堿(DHT)是從我國特有植物海南粗榧中分離出來的具有抗腫瘤活性的生物堿，其中HT和HHT抗腫瘤作用最強，我國在世界上首先將其用于急性髓細胞白血病的臨床治療，并獲得顯著療效［6-7］。研究表明，HT能通過多種途徑抑制蛋白合成和克隆形成，誘導(dǎo)白血病細胞凋亡［8-9］。然而，HT對急性早幼粒細胞白血病(APL)的作用及其機制的研究目前報道較少。本研究考察了HT對APL細胞株NB4細胞的生長抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用，推測HT可能通過下調(diào)Mcl-1蛋白發(fā)揮誘導(dǎo)NB4細胞凋亡的抗白血病作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人急性早幼粒白血病細胞株NB4購于ATCC。APL樣本細胞由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院提供。RPMI-1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司;臺盼蘭染料，PI，AO，EB購于美國 Sigma公司，Western-blot抗體:對照 β-Actin購自美國Santa Cruz公司，PARP、Bax、Bak、Bcl-2 和 Mcl-1單克隆抗體均購自美國Cell-Signaling公司;化學(xué)增強發(fā)光試劑盒購于英國Amersham Biosciences公司;Lipofectamine細胞轉(zhuǎn)染試劑盒購于美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人類急性早幼粒白血病細胞株NB4細胞均培養(yǎng)于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1 mmol/L谷氨酰胺及10%(v/v)經(jīng)加熱滅活的胎牛血清的R/MINI-1640培養(yǎng)液中。所有實驗用細胞均于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 外周血淋巴細胞的提取 經(jīng)患者同意后，抽取5 ml新確診未進食的APL患者血液。外周血淋巴細胞的提取采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心進行分離。將5 mL血液與5 ml PBS混合，輕柔吹吸。后將稀釋后的血液加到單核細胞分離液的液面上。3000 r/min離心10 min，將分離液從離心機中取出，吸取中間的淋巴細胞層。將分離的淋巴細胞養(yǎng)于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1 mmol/L 谷氨酰胺及20%(v/v)經(jīng)加熱滅活的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于 37°C、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加藥，于48 h后收集細胞。

1.4 生長抑制和細胞毒作用檢測 藥物對白血病細胞的生長抑制作用采用細胞計數(shù)法考察。取對數(shù)生長期細胞(2×105/m)接種于24孔板，2 ml/孔。加入不同濃度藥物孵育72 h后于顯微鏡下計數(shù)，依照如下公式計算細胞生長抑制率(GI)，(GI50:使細胞生長抑制率達50%時的藥物濃度)。IG=(對照孔細胞數(shù)-加藥孔細胞數(shù))/對照孔細胞數(shù)×100%。藥物的細胞毒作用通過臺盼藍排斥實驗檢測。各孔活細胞數(shù)與該孔總細胞數(shù)的比值即為該濃度條件下的細胞存活率。

1.5 AO-EB雙染法凋亡形態(tài)觀察 利用丫啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)雙染法考察凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化。取對數(shù)生長期細胞，以每孔2×105/mL的細胞密度接種于24孔板中，每孔2 ml。藥物作用后，取1 mL細胞懸液，離心，棄去上清液，重懸于30μL PBS中，然后加入AO/EB 等體積混合液 5μL(100 μg/ml AO，100 μg/mL EB)，混勻。取10μL混合液點于潔凈載玻片上，用蓋玻片封片，在熒光顯微鏡490 nm波長下記錄并觀察細胞的染色情況和形態(tài)學(xué)改變。細胞呈現(xiàn)AO著色的綠色熒光同時EB拒染，并出現(xiàn)核皺縮、邊緣化、發(fā)芽、發(fā)泡以及凋亡小體等典型凋亡形態(tài)的細胞被認為是早期凋亡細胞。細胞若呈現(xiàn)EB著色的紅色熒光，說明細胞已經(jīng)死亡，為壞死細胞或晚期凋亡細胞。

1.6 PI染色流式細胞術(shù)凋亡檢測 經(jīng)HT處理相應(yīng)時間后離心收集細胞(2×106個)，PBS洗滌后用200μL PBS重懸，加入10 ml預(yù)冷的75%乙醇中固定過夜后收集樣品。離心收集細胞，于500 μg/ml的RNase溶液中37℃孵育30 min后，加入PI染色液，使其終濃度為60 μg/ml。樣品DNA含量采用流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測，染料激發(fā)波長為488 nm，吸收波長為625 nm?？v坐標表示細胞數(shù)，橫坐標表示熒光強度即DNA含量。流式細胞儀每個樣品共收集10 000個細胞。相應(yīng)數(shù)據(jù)采用CELLQuest軟件(Becton Dickinson)進行分析處理。

1.7 Western Blot檢測 凋亡相關(guān)蛋白細胞總蛋白(100 μg)通過 RIPA裂解緩沖液［50 mmol/L Tris鹽酸，150 mmol/L 氯化鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，1%NP-40，0.5% 脫氧膽酸鈉，1 mmol/L PMSF，100 μmol/L leupeptin 和2 μg/mL aprotinin，pH 8.0］裂解得到。應(yīng)用Bradford法定量蛋白，通過SDS-PAGE將蛋白進行分離，應(yīng)用Bio-Rad電轉(zhuǎn)儀將蛋白濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。用0.2%的麗春紅染色液預(yù)染。用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜2 h后，加入10 mL稀釋濃度的待測蛋白特異性抗體，于4oC結(jié)合過夜。TBST洗滌后與標記的二抗室溫結(jié)合2 h后TBST洗滌，硝酸纖維素膜經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL kit，Amersham Biosciences)處理后，與膠片于曝光板中壓片，經(jīng)顯影液、定影液處理后掃描曝光片。

1.8 RNA干擾實驗 將siRNA電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染目的細胞，Mcl-1 siRNA(sc-35877)購于Santa Cruz Biotechology，Inc CA，方法見 Amaxa 電轉(zhuǎn)化手冊。收集1×106個對數(shù)生長期細胞，重懸 于 100 μL nucleofector solution(Amaxa Reagent V)，加入 100 pmol siRNA，運行 Amaxa T-016電轉(zhuǎn)化程序。電轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移到12孔板中，加入4 mL新鮮培養(yǎng)液37oC復(fù)蘇12 h，加入藥物處理，進行蛋白電泳免疫印記實驗。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計處理軟件分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示。多組均數(shù)間比較采用One-way ANOVA，有顯著差異時，再作兩兩比較的q檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HT對NB4細胞的生長抑制作用和細胞毒性作用 通過細胞計數(shù)法可對HT對APL細胞系NB4細胞的生長抑制作用和細胞毒作用進行考察。HT在40 nmol/L的濃度下就能強烈的抑制 NB4 細胞的生長，GI50為(32.0 ±2.5)nmol/L，HT處理NB4細胞72 h，HT呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制NB4細胞的生長(圖1)。NB4細胞經(jīng)HT 60 nmol/L處理72 h，細胞存活率均下降到20%以下(圖2)，并且在80 nmol/L HT的作用下細胞存活率快速下降。

圖1 HT對NB4細胞的生長抑制作用Fig.1 Growth inhibition of HT in NB4 cells

圖2 HT對NB4細胞的細胞毒作用Fig.2 Cytotoxicity of HT in NB4 cells

2.2 HT對NB4細胞的凋亡誘導(dǎo)作用 通過AO-EB染色的熒光顯微觀察和PI染色的流式細胞術(shù)考察了HT對NB4細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。100 nmol/L HT處理NB4細胞3 h、6 h、12 h，可顯著誘導(dǎo)NB4細胞凋亡，并且呈現(xiàn)良好的時間依賴關(guān)系，并可觀察到典型的細胞凋亡形態(tài)(圖3)。分別用50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L HT處理6 h，也可顯著誘導(dǎo)NB4細胞凋亡，并呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系，采用PI染色的流式細胞術(shù)可以檢測到顯著的SubG1凋亡峰，100 nmol/L HT處理NB4細胞6 h，約66%的NB4細胞發(fā)生凋亡(圖4)。

2.3 HT對NB4細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 HT可以引起HL-60細胞線粒體膜電位下降并導(dǎo)致caspase-9和 caspse-3 的活化［8］，而線粒體膜電位的下降主要由Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白所調(diào)控［3］。因此應(yīng)用Western Blot考察了HT處理 NB4 細胞后 Bax、Bak、Bcl-2 和Mcl-1的蛋白水平，PARP的活化情況。HT在100 nmol/L和200 nmol/L的濃度下處理NB4細胞6 h，并不活化和上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Bak，也不改變抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白水平，但可迅速顯著下調(diào)凋亡抑制蛋白Mcl-1，同時引起凋亡標志性蛋白PARP的裂解活化(圖5)。結(jié)果提示，HT誘導(dǎo)NB4細胞凋亡可能與凋亡抑制蛋白Mcl-1下調(diào)相關(guān)。

圖5 HT對凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.5 The levels of apoptosis regulating proteins after treated with HT

2.4 siRNA沉默 Mcl-1對 HT誘導(dǎo)NB4細胞凋亡作用的影響 利用RNA干擾技術(shù)，應(yīng)用Mcl-1 siRNA沉默NB4細胞Mcl-1的表達。NB4細胞預(yù)處理Mcl-1 siRNA后，Mcl-1蛋白表達被抑制，與空白載體對照相比，40 nmol/L HT處理細胞6 h，可以顯著地誘導(dǎo)NB4細胞凋亡并引起PARP的裂解(P＜0.05)(圖6)，結(jié)果提示，沉默Mcl-1可以顯著的提高HT對NB4細胞的凋亡作用。

圖6 siRNA沉默Mcl-1 HT誘導(dǎo)NB4細胞凋亡結(jié)果Fig.6 The influence of Mcl-1 siRNA on HT induced apoptosis in NB4 cells

2.5 HT對原代APL細胞凋亡誘導(dǎo)作用 采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心，提取APL患者的原代白血病細胞。HT處理樣本細胞6h，100 nmol/L HT分別誘導(dǎo)51.2%APL-1樣本細胞和 55.9%APL-2樣本細胞凋亡(圖 7)。Western Blot結(jié)果顯示，100 nmol/L HT處理樣本細胞6h，均可顯著下調(diào)APL-1和APL-2樣本細胞Mcl-1蛋白水平(圖8)。

圖7 HT誘導(dǎo)急性早幼粒白血病樣本細胞凋亡結(jié)果Fig.7 Apoptotic induction of HT in APL samples

圖8 HT下調(diào)急性早幼粒白血病樣本細胞Mcl-1蛋白Fig.8 HT down regulated levels of Mcl-1 in APL sample cells

3 討論

過去，我國率先將HT用于急性髓細胞白血病的臨床治療，其抗腫瘤作用主要為抑制腫瘤細胞DNA和蛋白質(zhì)的合成，但作用機制尚不明確［9］。本研究表明，HT對 APL細胞系 NB4細胞具有強的生長抑制作用和細胞毒性作用。本實驗中HT對NB4細胞的生長抑制作用和細胞毒性作用呈現(xiàn)良好的時間依賴和劑量依賴關(guān)系。HT對NB4細胞所產(chǎn)生的細胞毒性作用可能有賴于HT引起NB4細胞快速凋亡。100 nmol/L和200 nmol/L HT作用3 h可以分別誘導(dǎo)41%和63%NB4細胞凋亡。報道表明，HT可通過內(nèi)源性細胞凋亡通路誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡，并引起caspase-9和caspase-3的活化，以及CytoC的釋放［8］。為此，我們初步探討了HT作用NB4細胞后對線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白水平的影響。本研究表明，HT作用NB4細胞6 h后，線粒體Bcl-2家族凋亡蛋白Bax和Bak的蛋白水平?jīng)]有改變，提示凋亡促進蛋白Bax和Bak的蛋白表達沒有升高。Bcl-2為Bcl-2家族抗凋亡蛋白，HT并不影響B(tài)cl-2的蛋白水平，提示Bcl-2在HT誘導(dǎo)的NB4細胞凋亡過程中并不發(fā)揮決定作用。HT可以顯著迅速的引起NB4細胞Mcl-1的下調(diào)，并伴隨著凋亡標準性蛋白PARP的裂解活化。Mcl-1為Bcl-2家族中重要凋亡抑制蛋白，有報道表明，下調(diào)Mcl-1可以引起腫瘤細胞凋亡［3］。因此，HT誘導(dǎo)NB4細胞凋亡可能通過下調(diào)Mcl-1蛋白實現(xiàn)。我們通過細胞轉(zhuǎn)染，將Mcl-1蛋白siRNA轉(zhuǎn)染NB4細胞，沉默Mcl-1蛋白表達，結(jié)果顯示在對照組細胞中siRNA可以顯著下調(diào)Mcl-1的蛋白水平。在給予低劑量的HT時，對照空載細胞沒有出現(xiàn)明顯的細胞凋亡和PARP蛋白的裂解活化，而Mcl-1 siRNA沉默組細胞呈現(xiàn)顯著的細胞凋亡和PARP蛋白的裂解活化。因此，Mcl-1在HT誘導(dǎo)NB4細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的作用。這提示HT可能通過下調(diào)Mcl-1發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的抗白血病作用。為了進一步驗證我們的假設(shè)，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心的方法提取了APL患者的原代白血病細胞。HT可以顯著誘導(dǎo)樣本白血病細胞凋亡。Western Blot結(jié)果顯示，HT給藥后均可顯著下調(diào)APL-1和APL-2樣本細胞Mcl-1蛋白水平。

綜上所述，HT可以顯著的抑制NB4細胞的生長并對NB4細胞產(chǎn)生強的細胞毒性，HT對NB4細胞的細胞毒性作用可能通過誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)。通過對NB4細胞和臨床APL原代細胞的作用，提示HT可能通過下調(diào)Mcl-1蛋白發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的抗APL作用。

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