萬 磊，劉 健，黃傳兵，汪 元，諶 曦，張皖東，王桂珍，范海霞，葛 瑤，陳瑞蓮，曹云祥，縱瑞凱

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，合肥 230031)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病，疾病反復(fù)遷延易導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸變，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能喪失。RA病變并非局限于關(guān)節(jié)，常伴有關(guān)節(jié)以外的其他臟器病變，因肺含有豐富的結(jié)締組織和血管，因此肺組織受累幾率增加，RA肺病變會侵及肺、胸膜等，而侵及肺易導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化、肺動脈高壓等病變，嚴(yán)重危及患者生命［1，2］。隨著RA 的發(fā)生、發(fā)展易出現(xiàn)肺部病變，直接表現(xiàn)為肺功能減低，同時RA患者肺功能降低早于呼吸系統(tǒng)臨床表現(xiàn)及胸部X線片異常［9-10］，因此，RA患者肺功能檢測對于診斷和治療肺部病變意義重大。RA病程延長，肺受累的機(jī)率增高，影響RA患者后期的生活質(zhì)量［3］。研究表明［4］，具有健脾化濕通絡(luò)功效的中藥復(fù)方新風(fēng)膠囊(黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等組成)能顯著提高RA患者肺功能，下調(diào)致炎因子TNF-α、上調(diào)抗炎因子IL-10及改善肺部癥狀。為進(jìn)一步探討新風(fēng)膠囊對RA肺功能影響的作用機(jī)制，我們觀察新風(fēng)膠囊對佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠 TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路的影響，并闡述新風(fēng)膠囊改善RA肺功能的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性 Wistar大鼠60只，鼠齡8月左右，體質(zhì)量(200±20.8)g，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 藥品及試劑 新風(fēng)膠囊(XFC):安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，0.4 g/粒，批號20111203;陽性對照藥甲氨喋呤(MTX):上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，2.5 mg/片，批號20110812;陽性對照藥雷公藤多苷片(TPT):上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠生產(chǎn)，10 mg/片，批號20111002。弗氏完全佐劑(FCA):美國SIGMA公司，批號:098k8732;CD4、CD25單抗:美國 eBioscience公司，批號:11-0140、12-0210;TGF-β1單抗:美國santa cruz公司，批號:SC-146R，Samd3、Samd7 單抗:美國 Life Span公司，批號:LS-C56241、LS-C35742。

1.3 主要儀器 AniRes2003動物肺功能儀:北京貝蘭博科技有限公司生產(chǎn);KMI135型切片機(jī):德國 LEICA公司;DMLB型光鏡:德國LEICA公司;Epics XL型流式細(xì)胞儀:美國Beckman Coulter公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制、分組及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常對照 (NC)組和模型組，向模型組大鼠右后足跖皮內(nèi)注射FCA 0.1 ml致炎，復(fù)制成AA大鼠模型，并于第18天加強(qiáng)免疫一次［5］。致炎第19天后，將模型組大鼠隨機(jī)分為4組:模型對照(MC)組、XFC組、MTX組、TPT組，當(dāng)天給藥。各組給藥量:XFC組1.2 g·kg-1、TPT 組10 mg·kg-1，每天1 次;MTX組:3 mg·kg-1，每周1次;NC組、MC組給予等容積安慰劑生理鹽水灌胃，每天1次，各組連續(xù)用藥30 d。

2.2 大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)測算足趾腫脹度=(Vt-Vn)/Vn×100%(Vn、Vt分別代表造模前后的容積)，分別在造模前1 d、致炎后第18天、給藥后測量各組大鼠后足跖的容積，計算各組大鼠足跖腫脹度［6］。AI的計算:致炎第12天后開始觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，大鼠全身病變按5級評分法評價，根據(jù)未注射CFA的其余3只肢體病變程度累積積分，計算出 AI［7］。

2.3 肺功能測定 給藥30 d后，用動物肺功能儀測定大鼠肺功能。肺功能測定參數(shù):25%肺活量的最大呼氣流量(FEF25)、50%肺活量的最大呼氣流量(FEF50)、75%肺活量的最大呼氣流量(FEF75)、最大呼氣中期流量(MMF)、用力最大呼氣流量(PEF)。操作過程:用10%水合氯醛(0.30 ml/100 g)腹腔注射麻醉，于大鼠喉部縱向切開，橫向分離肌肉組織，剝離露出氣管，將氣管呈“T”字形切開后行氣管插管，用細(xì)繩系緊插管，防止插管脫落;將大鼠置于體描箱內(nèi)，保持頭低位，與動物呼吸機(jī)管路相連，行機(jī)械通氣，使肺擴(kuò)張以達(dá)到氣體交換目的，測定肺功能參數(shù);在測定過程中，采用了外加壓力的辦法，實現(xiàn)負(fù)壓呼氣方式，將二氧化碳排出體外，通過信號調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)呼吸頻率范圍為260次/min，潮氣量為100～150 ml，呼吸比調(diào)節(jié)為1∶2.5。通過軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、實時分析控制、曲線動態(tài)顯示、趨勢圖、肺功能參數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和存儲等。

2.4 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 將肺組織于多聚甲醛中固定6～8 h后，浸蠟、石蠟包埋并切片，HE染色;光鏡觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，確定肺泡炎癥程度［8］。肺組織無任何病理學(xué)改變:無肺泡炎(-);肺泡隔因細(xì)胞浸潤增寬，病變范圍局限在全肺的20%以下:輕度肺泡炎(+);病變范圍占全肺的20% ～50%:中度肺泡炎(++);呈彌漫性分布，病變范圍大于50%:重度肺泡炎(+++);分別記為0、1、2、3 分。

2.5 CD4+CD25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)的檢測取大鼠外周新鮮血液，將細(xì)胞調(diào)節(jié)每管106個細(xì)胞，分別加入 CD4 0.25 μg、CD25 1.0 μg，避光30 min;加紅細(xì)胞裂解液1 ml，避光30 min;用PBA洗兩遍，離心棄上清，加500μL PBA上流式細(xì)胞儀檢測。

2.6 肺組織 Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7 檢測 參照試劑盒鏈霉抗生物素蛋白-過氧化酶(SP)法進(jìn)行操作:一抗 Foxp3、TGF-β1、Smad3、Smad7單克隆抗體用抗體稀釋液1∶100稀釋，生物素化二抗山羊抗小鼠IgG 1∶500稀釋，顯色劑為二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，陰性對照采用0.01 mol/L PBS液代替一抗進(jìn)行染色。每張切片任選5個視野，采用圖象分析軟件Image-pro plus進(jìn)行圖像分析，用積分光密度(IOD)表示Foxp3、TGF-β、Smad3、Smad7 蛋白的表達(dá)。免疫組化半定量方法:切片結(jié)果按染色強(qiáng)度分為弱(淡黃)、中(黃)、強(qiáng)(棕黃)三等，并分別記為1、2、3分。觀察看片，計算各染色強(qiáng)度的細(xì)胞所占百分比Pi，據(jù)公式H=∑(i±1)×Pi(i:染色強(qiáng)度;Pi各染色強(qiáng)度細(xì)胞百分比;H:蛋白表達(dá)評分)計算出每張染色片的H值。H值范圍為0～400;0分為所有細(xì)胞均無染色，400分為所有細(xì)胞均為強(qiáng)染色，0～400之間為不同程度的蛋白表達(dá)水平.通常H＜100為陰性。為消除不同切片染色不一致帶來的誤差，本實驗所有切片均由2名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師采用雙盲法評估算分，每組切片中任選1張用0.01 M PBS液代替一抗進(jìn)行染色，為陰性對照。

2.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，各組間的數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析;兩兩比較采用q檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化 給藥前，MC組、MTX組、TPT組、XFC組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著高于NC組，大鼠體質(zhì)量明顯低于NC組(P＜0.05或P＜0.01)。給藥后，MC組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著高于NC組(P＜0.01);XFC組、MTX組、TPT組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于MC組(P＜0.05或 P＜0.01);XFC組與其他治療組比較，大鼠體質(zhì)量顯著升高(P＜0.01)。見表1。

3.2 大鼠肺功能的變化 與NC組相比，MC組大鼠肺功能參數(shù) FEF25、FEF50、FEF75、MMF、PEF降低;與 MC 組相比，XFC 組 FEF50、FEF75、MMF、PEF升高;與 XFC組比較，MTX組FEF50、FEF75、MMF、PEF 降低;TPT 組 FEF25、FEF50、FEF75、MMF 降低(P ＜ 0.05 或 P ＜0.01)。見表2。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化Table 1 Changes of body weight，paw swelling and arthritis index in rats(n=12)

表1 各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化Table 1 Changes of body weight，paw swelling and arthritis index in rats(n=12)

與 NC組比較，a:P ＜0.01，b:P ＜0.05;與 MC 組相比，c:P ＜0.01，d:P ＜0.05;與 XFC 組比較，e:P ＜0.01.

體質(zhì)量(W，g)足跖腫脹度(E，%)關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI，分)組別致炎前 給藥前 給藥后 致炎前 給藥后 致炎12天 給藥30天1.44 ±0.10 7.54 ±3.72 0.08 ±0.07 0.17 ±0.08 MC 184 ±15.4 211 ±18.9a 254 ±16.8a 1.45 ±0.12 21.5 ±7.86a 1.08 ±0.63a 7.08 ±0.76a MTX 190 ±16.7 222 ±19.0b 275 ±18.3ce 1.48 ±0.19 12.8 ±7.48d 1.00 ±0.64a 5.42 ±1.23c TPT 188 ±19.9 215 ±21.4a 283 ±19.8ce 1.47 ±0.17 11.9 ±9.10d 1.17 ±0.58a 5.00 ±1.14c XFC 189 ±16.5 219 ±18.3a 302 ±14.9c 1.46 ±0.12 11.4 ±5.83c 1.25 ±0.79a 5.33 ±1.15 NC 179 ±13.6 234 ±17.8 302 ±18.87c c

表2 各組大鼠肺功能各參數(shù)的變化Table 2 Changes of lung function parameter in rats(n=12)

表2 各組大鼠肺功能各參數(shù)的變化Table 2 Changes of lung function parameter in rats(n=12)

與NC 組比較，a:P ＜0.01，b:P ＜0.05;與MC 組相比，c:P＜0.01，d:P ＜0.05;與XFC 組相比，e:P ＜0.01，f:P＜0.05.

組別肺功能參數(shù)FEF25(ml/s) FEF50(ml/s) FEF75(ml/s) MMF(ml/s) PEF(ml/s)9.1 ±4.83 MC 32.7 ±2.86 27.0 ±6.09a 20.9 ±5.37a 28.5 ±2.98a 29.4 ±2.59a MTX 36.8 ± 3.68a 30.3 ±4.98a，e 24.1 ±5.88a，f 31.7 ±4.33a，f 33.1 ±3.18a，f TPT 35.8 ± 3.14a 32.3 ±5.02b，e 25.7 ±4.54a，f 31.9 ±3.38a，d，f 34.7 ±4.53c XFC 38.2 ±4.78 40.2 ±4.34c 34.4 ±10.3c 37.1 ±4.69c 37.8 ±4.34 NC 45.2 ±6.25 39.4 ±6.84 37.7 ±5.86 39.2 ±5.77 3 c

3.3 大鼠肺泡炎積分、外周血Treg及肺組織Foxp3變化 與NC組比較，MC組大鼠肺泡炎積分升高，外周血 CD4+CD25+Treg、肺組織Foxp3表達(dá)降低(P＜0.01)。與MC組相比，各治療組肺系數(shù)、肺泡炎積分降低，CD4+CD25+Treg、肺組織 Foxp3升高(P＜0.05或 P＜0.01)。與XFC組相比，陽性對照藥 MTX組CD4+CD25+Treg表達(dá)降低(P ＜0.05)。見表3，圖1。

表3 各組大鼠肺泡炎積分、Treg、Foxp3的變化Table 3 The changes of alveolitis integral，Treg，F(xiàn)oxp3 in rats(n=12)

表3 各組大鼠肺泡炎積分、Treg、Foxp3的變化Table 3 The changes of alveolitis integral，Treg，F(xiàn)oxp3 in rats(n=12)

與 NC組比較，a:P ＜0.01，b:P ＜0.05;與 MC 組相比，c:P ＜0.01，d:P ＜0.05;與 XFC 組比較，e:P ＜0.05.

組別 肺泡炎積分 CD4+CD25+Treg(%)Foxp3 NC 0.37 ±0.74 9.45 ±0.81 0.41 ±0.10 MC 2.25 ±0.70a 5.78 ±0.85a 0.13 ±0.03a MTX 1.97 ±0.35d 6.92 ±1.23b，c，e 0.33 ±0.05c TPT 1.62 ±0.51c 8.75 ±0.85c 0.40 ±0.04c XFC 1.75 ±0.46c 8.64 ±1.88c 0.37 ±0.07c

3.4 大鼠肺組織 TGF-β1/Smads信號通路的變化 MC組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3升高，Smad7降低;藥物干預(yù)后，TPT組、XFC組肺組織 TGF-β1、Smad3降低，Smad7升高，MTX 組Smad7升高(P＜0.05或 P＜0.01)。XFC 組與MTX組、TPT組之間比較無顯著差異(P＞0.05)。見表4，圖2。

表4 各組大鼠肺組織 TGF-β1、Smads、Smad7蛋白的變化Table 4 Changes of TGF-β1，Smads，Smad7 protein of lung tissue in rats(IOD，n=12)

表4 各組大鼠肺組織 TGF-β1、Smads、Smad7蛋白的變化Table 4 Changes of TGF-β1，Smads，Smad7 protein of lung tissue in rats(IOD，n=12)

注:與NC組比較，a P＜0.01;與 MC組相比，b P＜0.01.

組別 TGF-β1 Smad3 Smad7 NC 0.12 ±0.04 0.13 ±0.07 0.60 ±0.08 MC 0.42 ±0.05a 0.44 ±0.12a 0.16 ±0.05a MTX 0.33 ±0.06 0.32 ±0.08 0.53 ±0.15b TPT 0.24 ±0.08b 0.23 ±0.03b 0.54 ±0.12b XFC 0.22 ±0.04b 0.24 ±0.05b 0.53 ±0.13b

4 討論

圖2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)(SP，×200倍)Fig.2 Expressions of TGF-beta1，Smad3，Smad7 protein of lung tissue in rats(SP，× 200 times)

肺功能參數(shù)中MMF、PEF反映的是通氣功能，而 FEF25、FEF50、FEF75反映氣道功能。本組研究結(jié)果顯示，AA模型組大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、肺泡炎積分升高和肺部病理形態(tài)學(xué)改變，佐劑致炎后，大鼠在出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥同時，其肺功能參數(shù)水平 FEF25、FEF50、FEF75、MMF、PEF降低，說明炎癥的刺激進(jìn)一步導(dǎo)致免疫復(fù)合物的沉積，誘導(dǎo)出現(xiàn)肺部病變，出現(xiàn)肺功能降低和損害。而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AA大鼠肺組織TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)明顯升高，F(xiàn)oxp3蛋白、Smad7蛋白表達(dá)降低，同時，AA大鼠外周血CD4+CD25+Treg降低。提示Treg及其表面標(biāo)志物Foxp3可能參與肺功能降低的過程，Treg、Foxp3表達(dá)水平低下，出現(xiàn)免疫耐受降低，不能維持和調(diào)節(jié)正常的免疫功能，導(dǎo)致對TGF-β1/Smads通路調(diào)節(jié)功能紊亂。而TGF-β1/Smads通路表達(dá)失衡，TGF-β1水平過高會進(jìn)一步加重炎癥對肺組織的刺激，從而最終導(dǎo)致肺功能降低。這與我們前期研究相似。通過新風(fēng)膠囊干預(yù)后，AA大鼠體質(zhì)量明顯提高，肺功能參數(shù)FEF50、FEF75、MMF、PEF 改善，同時 AA 大鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、肺泡炎抑制。表明新風(fēng)膠囊不但能改善AA大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，而且能提高肺功能水平和抑制肺泡炎的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，新風(fēng)膠囊組中肺組織TGF-β1及Smad3蛋白表達(dá)降低的同時，Smad7及調(diào)節(jié)T細(xì)胞的表面標(biāo)志物Foxp3蛋白的表達(dá)升高，提示新風(fēng)膠囊可能是通過上調(diào)Foxp3的表達(dá)，促使 CD4+CD25-T細(xì)胞活化，活化的 CD4+CD25-T細(xì)胞進(jìn)一步向CD4+CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)換［11］。同時，通過下調(diào) TGF-β1的表達(dá)抑制炎癥進(jìn)一步發(fā)生，活化CD4+CD25+T細(xì)胞協(xié)同TGF-β1進(jìn)一步激活 TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路，降低膠原的表達(dá)和分泌，維持免疫耐受和組織(肺等)的修復(fù)。

TGF-β會促進(jìn)炎癥發(fā)展，且在炎癥部位活性增強(qiáng)，使成纖維細(xì)胞大量增殖，導(dǎo)致AA大鼠關(guān)節(jié)腫大，嚴(yán)重的出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化。TGF-β功能的發(fā)揮依賴于Smads蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控［12-14］。Ⅰ型 TGF-β 受體(TβRⅠ)被 TGF-β激活后能磷酸化 Smad3蛋白，磷酸化的 RSmad3與C-Smad3形成寡聚合物后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與其它轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，而Smad7是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要抑制性調(diào)控蛋白，能夠與TβRⅠ牢固結(jié)合，阻止 TβRⅠ磷酸化 Smad3蛋白，終止 TGF-β的信號傳導(dǎo)，從而阻止了炎性反應(yīng)的持續(xù)，造成對肺和關(guān)節(jié)等組織臟器的損傷。CD4+CD25+Treg是一種重要的調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞，它來源于胸腺的CD4+CD25-T細(xì)胞。CD4+CD25+Treg具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能特征。而Foxp3是CD4+CD25+Treg表面特異性標(biāo)志，在CD4+CD25+Treg的生長發(fā)育和功能發(fā)揮、維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)定起重要作用［15］。關(guān)于調(diào)控Foxp3表達(dá)的細(xì)胞因子最有爭議的是TGF-β，有研究者在體外培養(yǎng) CD4+CD25-Treg，并與 TGF-β、IL-2、TCR 及 CD28 混合培養(yǎng)，可誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)及激活免疫抑制物的產(chǎn)生［16］。

新風(fēng)膠囊其主要成分為黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等，以益氣健脾、化濕通絡(luò)諸法聯(lián)用，具有抗炎、消腫、鎮(zhèn)痛作用［17］。其中黃芪富含黃酮、多糖、甙類和多種氨基酸，因此能增強(qiáng)免疫功能，調(diào)節(jié)糖代謝，加速受損組織修復(fù)。而且黃芪能夠顯著降低肺系數(shù)及肺組織勻漿脂質(zhì)過氧化物含量，組織學(xué)檢查表明，黃芪組能明顯減輕博來霉素所致的肺損傷大鼠，說明黃芪對博來霉素致肺損傷有保護(hù)作用［18］。雷公藤具有免疫抑制作用，可抑制RA患者體內(nèi)異常免疫反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙能改善肺泡炎和纖維化，雷公藤T4單體也可減輕肺泡炎和肺纖維化程度，雷公藤毛單體腹腔注射對肺纖維化模型大鼠肺組織病理及肺羥脯氨酸含量也有影響，結(jié)果表明雷公藤毛單體可使肺泡炎和肺纖維化程度有所減羥，并使肺羥脯氨酸含量下降，說明其單體具有一定的抗肺纖維化的療效［19］。浸出物能抑制人中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，并顯著抑制中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞膜的甲基轉(zhuǎn)移酶、磷脂酶A2和前列腺素E2的分泌。黃芪、薏苡仁與雷公藤相配一方面可以調(diào)節(jié)免疫，另一方面可以防止雷公藤免疫抑制造成機(jī)體免疫功能過于低下。

TGF-β 在體內(nèi)能使 Treg 增殖［20］，而我們研究發(fā)現(xiàn)，在AA大鼠肺組織中TGF-β1表達(dá)水平升高，而大鼠血液中調(diào)節(jié)T細(xì)胞降低，可能是由于血液中大量TGF-β1游離至組織中，使血液中TGF-β1水平降低，從而不能促進(jìn)CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖，抑制了CD4+CD25+Treg的表達(dá)。因此，我們將進(jìn)一步研究血液中TGF-β1表達(dá)水平的含量，并探討其與CD4+CD25+-Foxp3+Treg表達(dá)的關(guān)系。

［1］MORI S，KOGA Y，SUGIMOTO M.Different risk factors between interstitial lung disease and airway disease in rheumatoid arthritis［J］.Respir Med，2012，106(11):1591-1599.

［2］WASSMUTH R，WAGNER U.Prognostic use of human leukocyteantigen genotyping for rheumatoid arthritis susceptibility，diseasecouse，and clinical stratification［J］.Rheum Dis Clin North Am，2002，28(1):13-37.

［3］LIU Jian，F(xiàn)AN Haixia，YANG Meiyun(劉 健，范海霞，楊梅云).Effects of Xinfeng capsule and it's influence on pulmonary function and life quality of patients with rheumatoid arthritis ［J］.Chin Archives TCM(中華中醫(yī)藥學(xué)刊)，2007，25(10):2061-2063.(in Chinese)

［4］LIU Jian，WAN Lei，F(xiàn)ENG Yun-xia，et al(劉 健，萬 磊，馮云霞，等).Investigate the treatment of rheumatoid arthritis reduced lung function and collaterals Jianpihuashitang［J］.T Clin Med TCM(中醫(yī)藥臨床雜志)，2011，23(6):471-473.(in chinese)

［5］XIONG Guolin，HUANG Haixiao，XIE Ling，et al(熊國林，黃海瀟，謝玲，等).The reproduction of an improved model of rheumatoid arthritis in rats［J］.J Med Chin People's Liberation Army(解放軍醫(yī)學(xué)雜志)，2007，32(2):121-123.(in Chinese)

［6］XU Shuyun，BIAN Rulian，CHEN Xiu(徐叔云，卞如濂，陳 修).Pharmacological experimental methodology(藥理實驗方法學(xué))［M］.3rd edition.Beijing:The people's medical publishing house，2002:919-921.(in Chinese)

［7］ZHANG Juntian(張鈞田).Modern pharmacology experiment methods(現(xiàn)代藥理實驗方法)［M］.Beijing:Beijing medical college and Beijing union medical college joint publishing house，1998:1383.(in chinese)

［8］SZAPIEL S V，ELSON N A，F(xiàn)ULMER J D，et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude，athym-icmouse ［J］.Am Rev Respir Dis，1979，120(4):893-899.

［9］BERGSTR M U，JACOBSSON LT，NILSSON J，et al.Pulmonary dysfunction，smoking，socioeconomic status and the risk of developing rheumatoid arthritis［J］.Rheumatology(Oxford)，2011，50(11):2005-2013.

［10］SKARE T L，NAKANO I，ESCUISSIATO D L，et al.Pulmonary changes on high-resolution computed tomography of patients with rheumatoid arthritis and their association with clinical，demographic，serological and therapeutic variables［J］.Rev Bras Reumatol，2011，51(4):325-30，336-337.

［11］LIU Jian，WAN Lei，LIU Lei，et al(劉 健，萬磊，劉 磊，等).The effect of Chinese medicine Xinfeng capsule on pulmonary function in patientswith rheumatoid arthritis［J］.Chinese Journal of Clinical Healthcare(中國臨床保健雜志)，2011，14(2):113-116.(in Chinese)

［12］LAN H Y，CHUNG A C.TGF-β/Smad signaling in kidney disease ［J］.Semin Nephrol，2012，32(3):236-243.

［13］ZI Z，CHAPNICK D A，LIU X.Dynamics of TGF-β/Smad signaling ［J］.FEBS Lett，2012，586(14):1921-1928.

［14］ZHAN Jing，WU Huiling，F(xiàn)ENG Jianying(詹靜，吳慧玲，馮劍穎).Expression of BMP/Smad signal transduction pathway leading rabbit mandibular condyle ［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版)，2006，35(5):485-490.(in Chinese)

［15］CAI Yongjun，SUN Wenji(蔡永君，孫文佶)Progress in regulatory T cells research ［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Sciences(浙江大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版)，2006，35(5):568-572.(in Chinese)

［16］CHEN W，JIN W，HARDEGEN N，et al.Conversion of peripheralCD4+CD25-naive T cells to CD4+CD25+regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3 ［J］.J Exp Med，2003，198(12):1875-1886.

［17］LIU Jian，WAN Lei，SHENG Changjian，et al(劉健，萬 磊，盛長健，等).Pulmonary function of patients with rheumatoid arthritis and Xinfeng Capsule influence［J］.T Clin Med TCM(中醫(yī)藥臨 床 雜 志)，2010，22(9):798-802.(in Chinese)

［18］WANG Yongsheng，XU Xiaoya，YANG Bo，et al(王永生，徐小雅，楊 波，等)Study on the Therapeutical effect of astragaloside IV on bleomycin-induced lung fibrosis in rats ［J］.Modern Preventive Medicine(現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué))，2012，39(12):3090-3092.(in Chinese)

［19］YANG Sufang，QIU Songping，LIN Jingyu，et al(楊素芳，邱頌平，林靜瑜，等).Tripterygium glycosides intervention effect on pulmonary fibrosis in rats［J］.Fujian University of Traditional Chinese Medicine(福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報)，2011，21(3):36-39.(in Chinese)

［20］CHEN Z F，XU Q，DING J B，et al.CD4+CD25+Foxp3+Treg and TGF-beta play important roles in pathogenesis of Uygur cervical carcinoma［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2012，33(5):502-507.